肺癌是当今世界上对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一, 我国肺癌的发病率和死亡率也逐年递增^[1]。尽管肺癌的检测方法及治疗手段在不断改进, 但大多数肺癌患者的预后仍没有明显改善, 5年总体生存率仅为10% ~ 15%^[2]。研究表明, 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)在43%~ 89%的非小细胞肺癌(non-small celllung cancers, NSCLC)中表达上调, 它在肿瘤的形成以及介导瘤细胞的生物学行为上发挥着重要的作用, 是目前NSCLC治疗的重要靶点之一^[3]。吉非替尼(gefitinib)是靶向EGFR药物之一, 为酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKIs), 临床试验表明它对部分NSCLC患者具有较好的疗效^[4-5]。然而, 并非所有NSCLC患者均表现出较好的疗效, 因此寻求能够预测吉非替尼敏感性的预后指标很重要。近年来研究发现, NSCLC的EGFR酪氨酸激酶区的突变与肿瘤对TKIs药物的反应有关^[6-7]。这些突变主要是EGFR第19外显子缺失及第21外显子点突变, 最常见于亚洲女性、腺癌、不吸烟患者, 而这些临床病理特征与对TKI s药物的反应密切相关^[8-9]。研究认为:EGFR基因突变很可能是肺癌患者应用TKI s药物有无疗效的关键因素, 因而针对NSCLC患者检测EGFR基因状态可以为临床靶向治疗提供重要的信息。RAS途径是介导EGFR下游信号活化的主要信号传导途径之一。在NSCLC中k-ras突变常见于腺癌, 研究报道其突变率为7%~ 40%不等, 突变主要为12或13密码子点突变, 这类患者对TKIs药物敏感性差, 预后不良^[10-11]。由于NSCLC中EGFR和k-ras基因突变与EGFRTKIs敏感性以及耐药性相关, 因此快速准确检测NSCLC瘤组织中这两种基因的突变, 有助于筛选出适合吉非替尼治疗的人群。本研究对170例NSCLC肿瘤标本分别进行EGFR和k-ras基因突变检测, 并分析突变与其临床病理特点的关系。

材料和方法

材料

收集北京协和医院病理科2003年1月至2008年12月手术切除的170例NSCLC患者的肿瘤标本。170例患者中男性86例, 女性84例; 年龄29 ~ 83岁, 平均年龄60. 6岁, 中位年龄62岁; 有吸烟史患者65例, 无吸烟史患者105例; 病理证实的肺腺癌136例(含细支气管肺泡癌22例)、鳞癌24例、大细胞癌10例。按pTNM (pathological tumor-nodemetastasis)分期标准:Ⅰ期66例、Ⅱ期29例、Ⅲ期51例、Ⅳ期24例。所有患者术前均未接受过抗肿瘤治疗。

DNA提取

所有手术切除标本均用4%中性甲醛固定, 经石蜡包埋, 常规HE染色, 筛选出肿瘤成分>80%的瘤组织块切片。应用显微切割技术及北京天根生物技术有限公司组织基因DNA提取纯化试剂盒从石蜡组织中提取DNA, 将提取的DNA用于基因突变检测。

基因突变检测

使用Delivering Pharmacogenomics公司推出的EGFR和k-ras突变检测试剂盒(即EGFR Scorpion Kit, k-ras Scorpion Kit; DxS Ltd., Manchester, 英国), 根据试剂盒说明书检测EGFR第18、19、20和21外显子突变以及k-ras基因12、13密码子突变。总反应体系均为25μl, 其中包括模板DNA5μl, 反应混合液20 μl (含Ta q酶, Scorpions引物及反应缓冲液等); 每次反应均设置阳性及阴性对照。所有的反应试剂均由此试剂盒提供。荧光即时定量PCR仪型号为ABI 7500。EGFR与k-ras基因突变检测的PCR反应条件分别为95℃ 10 min; 95℃ 30 s, 61℃ 1 min, 共循环40次; 95℃ 10 min; 95℃ 30 s, 60℃ 1 min, 共循环40次。反应结束后即时PCR仪自动以扩增曲线的形式输出结果。突变结果根据DxSEGFR、k-ras突变检测试剂盒使用说明书判读原则进行判读。

统计学分析

将所有临床病理资料, 包括年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小、淋巴结转移情况、肿瘤分化程度、组织学分型、pTNM分期以及EGFR、k-ras基因突变结果输入计算机, 应用SPSS(Version 15. 0)软件, 采用卡方检验及Fisher's精确概率法进行检验, P﹤ 0. 05表示差异有统计学意义。比较不同患者年龄、性别、TNM分期、组织学类型、吸烟史和淋巴结转移情况等亚组中EGFR和k-ras基因突变率的差异。

结  果

EGFR及k-ras基因突变检测结果

170例NSCLC标本EGFR突变的总检出率为49. 4% (84/170), 第18外显子未检测到点突变反应峰; 39例检出第19外显子缺失突变(图 1), 突变检出率为22. 9% (39/170);4例第20外显子存在插入突变, 2例为第20外显子S 768I点突变, 突变检出率为3. 5% (6/170);34例第21外显子为L 858R点突变(图 2), 3例为L 861Q点突变, 突变检出率为21. 8% (37/170);此外, 2例检出第20和21外显子混合性突变, 即第20外显子T 790M点突变和第21外显子L 858R点突变同时并存(图 3), 突变检出率为1. 2% (2/170)。

图  1  中分化腺癌组织(57号标本)EGFR基因第19外显子缺失(曲线M)

曲线W:野生型扩增曲线; EGFR:表皮生长因子受体

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图  2  细支气管肺泡癌组织(62号标本)EGFR基因第21外显子L858R点突变(曲线M)

曲线W:野生型扩增曲线; EGFR:同图 1

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图  3  高分化腺癌组织(103号标本)EGFR基因第21外显子L858R点突变(曲线M₁)及第20外显子T790M点突变(曲线M₂)

曲线W:野生型扩增曲线; EGFR:同图 1

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170例NSCLC标本中检测到14例k-ras基因突变, 突变检出率为8. 2% (14/170), 均位于12密码子, 其中8例为12CYS点突变(图 4), 突变检出率为4. 7% (8/170);3例为12ASP点突变, 突变检出率为1. 8% (3/170);3例为12VAL点突变, 突变检出率为1. 8% (3/170)。

图  4  高分化腺癌组织(30号标本)k-ras基因12CYS点突变(曲线M)

曲线W:野生型扩增曲线

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k-ras与EGFR基因突变的关系

未发现EGFR基因突变与k-ras基因突变存在同一NSCLC标本中, 84例EGFR基因突变肿瘤标本中未检测到k-ras基因突变(图 1, 5), 14例k-ras基因突变肿瘤标本中亦未检测到EGFR基因突变(图 4, 6)。

图  5  EGFR基因第19外显子缺失中分化腺癌组织(57号标本)未检测到k-ras基因突变扩增曲线

曲线W:野生型扩增曲线; EGFR:同图一

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图  6  k-ras基因12CYS点突变高分化腺癌组织(30号标本)未检测到EGFR基因突变扩增曲线

曲线W:野生型扩增曲线; EGFR:同图一

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EGFR及k-ras基因突变与临床病理特征的关系

腺癌、鳞癌和大细胞癌EGFR基因突变的检出率分别为60. 3% (82/136)、0 (0/24)和20% (2/ 10), 腺癌患者EGFR基因突变率明显高于鳞癌及大细胞癌, 腺癌与非腺癌EGFR基因突变比较差异具有统计学意义(P﹤0. 001);136例腺癌中细支气管肺泡癌(15/22)和其他类型腺癌(67/114)的EGFR基因突变率比较, 差异无统计学意义(P> 0. 05)。比较EGFR基因突变与NSCLC各临床病理特征的关系, 发现EGFR基因突变常见于女性、不吸烟、肿瘤较小(≤3 cm)且分化程度较好者(P﹤ 0. 05), 而EGFR基因突变与患者年龄、淋巴结是否转移及疾病pTNM分期等则无显著相关性(P> 0. 05) (表 1)。

表  1  非小细胞肺癌组织EGFR和k-ras基因突变与临床病理特征的关系

临床特征	例数	EGFR基因				k-ras基因
		突变例数(%)	无突变例数(%)	P值*		突变例数(%)	无突变例数(%)	P值*
性别	170
男性	86	33 (39. 3)	53 (61. 6)	0. 004		10 (71. 4)	76 (48. 7)	0. 103
女性	84	51 (60. 7)	33 (38. 4)			4 (28. 6)	80 (51. 3)
年龄	170
≤60	74	36 (42. 9)	38 (44. 2)	0.861		5 (35. 7)	69 (44. 2)	0.538
>60	96	48 (57. 1)	48 (55. 8)			9 (64. 3)	87 (55. 8)
吸烟史	170
有	105	61 (72. 6)	44 (51. 2)	0. 004		6 (42. 9)	99 (63. 5)	0. 129
无	65	23 (27. 4)	42 (48. 8)			8 (57. 1)	0. 117
肿瘤大小(cm)	170
≤3	70	42 (50. 0)	28 (32. 6)	0. 021		3 (21. 4)	67 (42. 9)	0. 117
>3	100	42 (50. 0)	58 (67. 4)			11 (78. 6)	89 (57. 1)
组织学类型	170
腺癌	136	82 (97. 6)	54 (62. 8)	＜0. 001		10 (71. 4)	126 (80. 8)	0. 483
非腺癌	34	2 (2. 4)	32 (37. 2)			4 (28. 6)	30 (19. 2)
分化程度	170
高分化	67	46 (54. 8)	21 (24. 4)	＜0. 001		4 (28. 6)	63 (40. 4)	0. 386
中-低分化	103	38 (45. 2)	65 (75. 6)			10 (71. 4)	93 (59. 6)
淋巴结转移	170
无	76	43 (51. 2)	33 (38. 4)	0. 093		8 (57. 1)	68 (43. 6)	0. 329
有	94	41 (48. 8)	53 (61. 6)			6 (42. 9)	88 (56. 4)
pTNM分期	170
Ⅰ期	65	34 (40. 5)	31 (36. 0)	0. 552		8 (57. 1)	57 (36. 5)	0. 129
Ⅱ-Ⅳ期	105	50 (59. 5)	55 (64. 0)			6 (42. 9)	99 (63. 5)
EGFR:表皮生长因子受体; *P值为有无突变病例间的比较

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腺癌、鳞癌和大细胞癌k -ras基因突变的检出率分别为7. 4% (10/136)、12. 5% (3/24)和10% (1/10), 腺癌与非腺癌k-ras基因突变率比较差异无统计学意义(P>0. 05)。k-ras基因突变与患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小、肿瘤分化程度、淋巴结转移、疾病pTNM分期等均无显著相关性(P> 0. 05) (表 1)。

EGFR和k-ras基因突变与应用靶向药物临床疗效的关系

2例EGFR第19外显子缺失突变中分化腺癌患者, 术后pTNM分期分别为ⅢA期和Ⅳ期, 应用吉西他滨(健择)+顺铂一线化疗后分别在第2及第5个疗程后病情进展, 胸部CT示肺内多发转移结节, 改用吉非替尼(易瑞沙, Iressa)治疗后病情缓解, 缓解时间分别为18和10. 5个月, 肿瘤进展时间(time to progression, TTP)分别为19和11. 5月, 总生存期分别为24和20个月。另有2例中分化腺癌患者EGFR和k-ras基因均未检测到突变, 术后pTNM分期分别为IIB期和IIIB期, 行常规化疗, 术后20和17个月病情进展, 出现肺、骨多发转移, 分别于术后22及18个月服用吉非替尼, 但治疗后均无明显缓解, 疾病继续进展, 分别于术后25及23个月死亡。

讨  论

根据组织学类型不同, EGFR可过表达于40% ~ 80%的NSCLC中^[12]。吉非替尼是一种小分子EG FR抑制剂, 它可通过与EGFR酪氨酸激酶域的ATP结合袋结合而抑制EGFR的活性。然而, EGFR过表达与患者对吉非替尼的反应并没有相关性。Paez等^[6]和Lynch等^[7]的研究结果显示EGFR的体细胞突变和NSCLC患者对吉非替尼的敏感性密切相关, 这些突变均发生在酪氨酸激酶域的ATP结合域附近, 如发生在第19外显子上的缺失突变, 或发生在第18和21外显子上的替代突变。此外, 还发现女性、非吸烟者、腺癌或者细支气管肺泡癌及东亚患者EGFR的突变率高。本研究表明, EGFR基因突变多见于女性、不吸烟者、肿瘤较小(≤3 c m)且分化相对较好的腺癌, 而与其他因素, 如患者年龄、淋巴结是否转移及疾病的pTNM分期等均无显著的相关性。然而, 曾有关于细支气管肺泡癌EGFR突变率高于其他类型腺癌的报道^[13], 但本研究显示细支气管肺泡癌和其他类型腺癌患者EGFR基因突变率差异并不显著。日本、中国台湾、韩国、新加坡及中国内地的研究均表明, 用吉非替尼治疗NSCLC在东方人群中的整体生存率和缓解率明显优于西方人群, 并且吉非替尼对既往化疗失败的局部晚期或转移性NSCLC患者有较好的疗效和安全性^[14-16]。本研究也显示存在EGFR基因突变的患者吉非替尼二线治疗的疗效优于野生型患者, 用药后疾病稳定, 疾病缓解时间和总体生存期均延长。Kalikaki等^[17]研究提示, EGFR体细胞突变能够预测NSCLC患者对靶向药物的敏感性。因此, 检测NSCLC患者肿瘤组织中EGFR基因突变, 从中筛选出对EGFRTK抑制剂敏感的患者, 进行有针对性的靶向治疗, 已被众多专家所认同。

Slebos等^[18]于1990年发现肺腺癌组织中有k-ras基因突变, 其主要为12或13密码子点突变, 并认为它是预后不良的分子标记。研究显示, k-ras基因突变与NSCLC患者对EGFRTKIs耐药有关, 突变的k-ras基因不依赖于上游EGFR活化, 不断激活MAPK信号途径的级联反应, 导致瘤细胞增殖、转移以及抵抗凋亡^[19-20]。本研究检测了170例NSCLC组织k-ras基因突变, 突变检出率为8. 2% (14/170), 均位于12密码子, 包括12CYS点突变(GGT>TGT)、12ASP点突变(GGT>GAT)及12VAL点突变(GGT>GTT)。国外报道k-ras突变在肺腺癌的发生率为20% ~ 30% ^[20], 但本研究发现k-ras突变在中国NSCLC人群的发生率较低, 且与患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小、肿瘤分化程度、组织学类型、淋巴结转移、pTNM分期等均无显著的相关性。

Kosaka等^[21]首先报道了EGFR和k-ras基因突变不同时存在, 其原因可能与EGFR传导通路下游的k-ras-MAPK信号途径有关。k-ras与EGFR基因突变几乎从不同时发生于同一NSCLC中, 提示两者的基因突变在肺癌的发生中是相互排斥的^[22]。本研究也发现14例k-ras基因突变的肿瘤组织中未检测到EGFR基因突变, 同时84例EGFR基因突变的肿瘤组织中亦未检测到k-ras基因突变, 证实中国人群k-ras基因突变与EGFR基因突变在同一NSCLC中亦不同时存在。

目前关于基因突变的检测方法很多, 本研究选用ARMS^TM和Scorpions两种技术的即时PCR方法检测NSCLC组织中的EGFR和k-ras基因突变。这两种技术的结合, 使检测方法具有高度敏感性和特异性, 且检测结果与DNA直接测序法完全一致, 准确率高达100%。在此之前笔者曾分别应用直接测序和即时PCR, 对北京协和医院82例NSCLC组织标本进行EGFR基因突变检测, 结果显示前者检出率为30. 5%, 后者检出率为51. 2%, 两者比较差异具有显著统计学意义^[9], 提示后者具有高度敏感性和特异性。此外, 本研究检测方法还能避免常规PCR反应过程中的污染, 能够为临床医师提供准确可靠的检测信息, 进而可以指导其选择最适合的治疗方案。

综上, EGFR基因与k-ras基因突变在同一NSCLC不同时存在, 提示两者的基因突变在肺癌的发生中是相互排斥的, 两种基因可能通过不同的分子机制在肺癌的发生及抗肿瘤靶向治疗中起作用。最近, 应用小分子酪氨酸激酶抑制剂(如吉非替尼)的临床试验得到了鼓舞人心的结果^{[4-5, 15, 17]}, 使众多肺癌患者尤其是晚期患者看到了抗癌曙光。本研究提供的NSCLC的分子信息有助于临床医师选择更好的治疗方案, 如靶向EGFR和k-ras基因突变的个体化治疗, 从而可延长肺癌患者的生存期, 改善其生活质量。