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Feasibility of Signal Transducers and Activators of Transcription 3 Inhibitor WP1066 as a Novel Target for Neuropathic Pain
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摘要:目的 观察Janus激酶2(Janus kinase 2, JAK2)/信号转导和转录激活子3(signal transducers and activators of transcription 3, STAT3)通路抑制剂WP1066对神经病理性疼痛的影响。方法 12只体重180~200 g雌性SD大鼠用随机数字表法分为WP1066组及对照组(n=6), 均行双侧坐骨神经结扎手术, 两组于术前1 d、术前及术后第3、5天分别经鞘内注射容量为10 μl的WP1066(10 mmol/L溶于二甲基亚砜)或二甲基亚砜, 于术前及术后第3、5、7、10、14天进行动物行为学检测, 观察大鼠对机械、热及丙酮冷刺激的反应。术后第14天处死大鼠, 于L4~L6腰膨大脊髓背角处取材, 使用RT-PCR及Western blot检测STAT3、细胞因子信号抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3, SOCS3)、JAK2 mRNA及蛋白水平。结果 大鼠机械缩足反射阈值、热刺激缩足反射潜伏期和冷痛阈值分别从第3、5、5天开始, WP1066组较对照组明显升高, 差异具有统计学意义(P < 0.05)。与对照组相比, WP1066组STAT3、SOCS3、JAK2 mRNA表达均明显降低(P < 0.05);WP1066组磷酸化STAT3、SOCS3、JAK2蛋白水平均亦明显降低(P < 0.05)。结论 WP1066可明显改善大鼠神经病理性疼痛, 可能为治疗神经病理性疼痛提供新的靶点。
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关键词:
- 神经病理性疼痛 /
- JAK/STAT通路 /
- WP1066 /
- 双侧坐骨神经结扎
Abstract:Objective To evaluate whether the Janus kinase 2(JAK2)/signal transducers and activators of transcription 3 (STAT3)inhibitor WP1066 could be a novel therapeutic target for neuropathic pain and its molecular mechnism.Methods Twelve female SD rats weighing 180-200 g were randomly divided into WP1066 group and control group(n=6) using the random number table. Rats in both groups underwent bilateral chronic sciatic nerve constriction injury (bCCI). WP1066 (10 μl, 10 mmol/L in dimethyl sulfoxide) or the equal volume of dimethyl sulfoxide was applied through the intrathecal tube one day before surgery, just before surgery, and 3 and 5 days after surgery in the WP1066 group and control group, respectively. Behavior tests were performed before surgery and 3, 5, 7, 10, and 14 days after the surgery to observe the rats' reactions to mechanical, thermal, and cold stimula-tions. The rats were killed on the 14th postoperative day. The dorsal horn of the spinal cord (L4-L6) was harvested, followed by the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting to investigate the activation of the JAK2/STAT3 pathway.Results The pain-related behavior changes were significantly better in the WP1066 group than in the control group. WP1066 significantly inhibited the JAK2, suppressor of cytokine signaling 3(SOCS3), and STAT3 mRNA in rats with bCCI, and significantly decreased the ratio of JAK2, SOCS3 and phosphorylation of STAT3(p-STAT3) protein expression on the 14th postoperative day.Conclusions The administration of WP1066 can remarkably improve neuropathic pain in bCCI rats by inhibiting the STAT3 signaling pathway. Therefore, WP1066 may be a novel target for neuropathic pain. -
青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis，AIS)是最常见的儿童脊柱畸形，在青春期进展最快，发病率为2%~3%，也有报道为5.2%[1-2]。严重AIS带来患者自信心下降、焦虑、疼痛、肺部并发症、心肺和运动功能受限等一系列问题，为患者、家庭及社会带来严重的心理及经济负担[3-8]。
目前治疗脊柱侧凸的方法分手术治疗和保守治疗。采取保守治疗的患者需制订适当的治疗方案，避免病情进展。国际脊柱侧凸研究协会(Scoliosis Research Society，SRS)将“观察”和“支具”列为脊柱侧凸的保守治疗方法，而国际脊柱侧凸矫形与康复治疗协会(Society on Scoliosis Orthopaedic and Rehabilitation Treatment, SOSORT)将脊柱侧凸特定性训练(scoliosis specific exercise，SSE)也纳入保守治疗范畴[9]。随着医疗条件的改进，“观察”这一保守治疗方案已不能满足患者及家长越来越高的健康需求，更多患者开始选择SSE作为治疗方法之一。本研究观察了SSE对轻度AIS患者的治疗效果，旨在为临床采用SSE治疗AIS提供依据。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性收集2016年1月至3月，在北京协和医院物理医学康复科门诊接受SSE矫形治疗的患者临床资料，包括年龄、性别、身高、体重、Cobb角度、轴向躯干旋转(angle of trunk rotation，ATR)角度、脊柱侧凸研究学会患者问卷-22(Scoliosis Research Society Patient Questionnaire-22, SRS-22)评分等。
纳入标准：(1)年龄10~18岁；(2)脊柱在冠状面侧弯角度大于10°(由Cobb角测算)[10]；(3) Cobb角10°~25°；(4)确诊为特发性脊柱侧凸；(5)首次并严格按照要求完成SSE。需同时满足上述各项标准。
排除标准：(1)就诊前接受过其他保守治疗，如支具、矫正体操等；(2)既往有脊柱相关疾病史及手术史。
本研究已通过中国医学科学院北京协和医院伦理审查委员会审查(审批号: S-K1005)。
1.2 康复矫正方案
综合SOSORT提出的7种保守治疗方案，以德国Schroth体操[11]和意大利脊柱侧凸科学训练法(scientific exercise approach to scoliosis，SEAS)为基础[12]，结合我院自身经验，对患者进行基于PUMC分型[13]的脊柱侧凸保守治疗。通过影像学、体态、功能等专项评估，为患者制订个体化SSE训练，包括日常生活训练、强化体操训练、患者宣教和被动手法[14]。每天日常生活训练1 h以上; 每周5~7次强化体操训练，每次30 min以上; 坚持6个月。
日常生活训练以胸椎右侧凸、腰椎左侧凸患者为例(图 1, 2)，首先令患者体会中轴延伸感，随后进行脊柱三维空间的逐一自我矫正:(1)冠状面，为使脊柱处于中立位，理论上需在腰椎施加斜向右上方的力，同时在胸椎施加斜向左上方的力，但在实际训练中，患者很难同时进行腰椎斜向右上方和胸椎斜向左上方的运动。故在训练初期，选取两个侧凸中的主凸优先治疗，主凸的Cobb角更大。如果胸椎和腰椎Cobb角接近，则选择患者较易完成的施力方向优先矫正。(2)水平面，理论上需对胸椎侧凸节段施加逆时针旋转力，同时对腰椎侧凸节段施加顺时针旋转力，以去除椎体旋转，但在实际训练中，患者同时进行腰椎逆时针和胸椎顺时针运动十分困难，故初期优先训练椎体旋转较大的侧凸；如椎体旋转程度相似，则优先训练ATR较大的侧凸；如ATR接近，则优先选择患者较易完成的施力方向予以矫正。(3)矢状面，如果患者存在生理曲度减少，则在T12~L1处施加一个向前的力，以矫正脊柱的生理曲度。(4)在患者保持矫正姿态后，即可进行稳定性训练，双手向下按桌子，躯干前屈或后伸，轮替抬脚跟或抬腿，全天累计时间达1 h以上。(5)日常生活中要求患者保持左髋高、左肩高的站姿或坐姿。
强化体操训练以腰椎左侧凸患者为例，矫正时取左侧卧位，顶椎下垫高(将脊柱处于中立位)，屈曲左下肢，右下肢水平抬高，右脚跟向下发力。运动中可观察到凹侧肌肉隆起，腰椎明显向凹侧移动(图 3)。
1.3 康复评定方法
1.3.1 测量Cobb角
SSE治疗前和治疗6个月后，由一名骨科医师和一名康复科治疗师同时测量Cobb角，取二者均数作为每次的测量值。
1.3.2 测量ATR角
SSE治疗前和治疗6个月后，由治疗师测量患者ATR角。患者双脚相距10 cm背对治疗师站立，双手合十，缓慢向前弯腰至治疗师的视线与患者背部不等高最显著处平行，并将Scoliometer中间凹槽置于棘突，为避免人为产生不对称的力量，检查者将单个手指放于凹槽正上方，读取水银颗粒对应的数据。测量两次取平均值。
1.3.3 SRS-22量表评估
SRS-22量表是SRS专门针对脊柱侧凸患者推出的综合评估量表，主要分析患者运动功能、脊柱疼痛、自我感觉、心理健康和治疗满意度5个部分共22道题，每题1~5分，各部分得分是其下所有问题得分的平均数，得分越高说明患者状态越好[15]。患者需在SSE治疗前和治疗6个月后分别填写SRS-22量表。
1.4 统计学处理
采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。对数据进行正态检验和方差齐性检验，符合正态分布且方差齐的计量资料以均数±标准差表达，治疗前后的比较采用配对t检验；非正态分布的计量资料以中位数(四分位数)表示，治疗前后比较采用非参数秩和检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般临床资料
最终31例符合入选和排除标准的患者入选本研究，其中男性6例，女性25例，平均年龄(12.97±1.82)岁，体重(45.5±8.0)kg，身高(157.9±7.5)cm，Cobb角平均19.23°±2.85°，ATR角平均7.16°±1.66°。根据PUMC分型[13]，Ⅰ型13例，Ⅱ型15例，Ⅲ型3例。
2.2 Cobb角和ATR角
患者治疗6个月后Cobb角和ATR角均较治疗前减小，差异有统计学意义(Cobb角：16.29°±5.05°比19.23°±2.85°，t=2.955，P=0.006；ATR角：5.97°±2.22°比7.16°±1.66°，t=4.799，P=0.000)。
2.3 SRS-22量表评分
采用SSE治疗6个月后，患者运动功能、脊柱疼痛、自我感觉及满意度评分均较治疗前增加，但只有满意度的前后差异有统计学意义[5.0(4.0，5.0)分比3.0(3.0，3.0)分，Z=0.000，P＜0.05]；治疗后心理健康评分较治疗前降低，但差异无统计学意义(表 1)。
表 1 SSE治疗前后SRS-22量表中各项指标的评分比较[M(P25, P75)]分组 运动功能 脊柱疼痛 自我感觉 心理健康 满意度 治疗前 4.6(4.2, 5.0) 4.8(4.6, 5.0) 4.2(4.0, 5.0) 4.8(4.2, 5.0) 3.0(3.0, 3.0) 治疗后 4.8(4.2, 5.0) 5.0(4.6, 5.0) 4.6(4.0, 5.0) 4.6(4.2, 5.0) 5.0(4.0, 5.0) Z值 -0.532 -0.310 -0.778 -1.039 -4.817 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05 SSE:脊柱侧凸特定性训练；SRS-22:脊柱侧凸研究学会患者问卷-22 3. 讨论
本研究对31例轻度AIS患者进行为期6个月的SSE矫正干预，治疗后患者Cobb角和ATR角均较治疗前减小，差异具有统计学意义，且患者对治疗效果满意。
我国脊柱侧凸的治疗原则与北美相似：(1)Cobb角在10°~25°之间的患者仅予定期复查，不采取任何措施；(2)处于生长期且25°＜Cobb角≤45°的患者，采用支具治疗；(3)处于生长期且Cobb角＞45°或停止生长后Cobb角＞50°者，采取手术治疗。但在临床实践中，仅定期复查无法满足Cobb角在10°~25°轻度AIS患者及家长对健康和美观的诉求。有研究表明，对轻度AIS患者不采取任何治疗措施，6个月后Cobb角平均增加5.4°，当病情进展快时Cobb角增加9.6°[16-17]。由此推断，观察并非轻度AIS患者的最佳首选方案。
AIS患者的Cobb角由两部分组成，脊柱的结构性改变以及塌陷。脊柱的结构改变需手术干预，而改善塌陷则可通过平卧、牵引等去重力手段实现[18]。SSE正是通过自我矫正有效减少脊柱塌陷，而非矫正脊柱侧凸的结构性改变，不会给患者带来任何伤害。
目前SSE治疗脊柱侧凸的效果缺少高质量研究，致使SSE并未获得普遍认可[19]。一项随机对照研究显示，SSE可减轻脊柱畸形，提高脊柱侧凸患者的生活质量[20]。SSE不仅可改善Cobb角，还可改善患者体型[21]。本研究显示，SSE可以减少ATR角，有效改善“剃刀背”，使患者体型更美观，增强患者自信。对患者而言，改善ATR角可能比Cobb角更重要，因为Cobb角是通过X线片测量脊柱侧凸严重情况，对医生的意义更大，而ATR角从外观上间接反映脊柱侧凸的严重情况，这种直观改善会带给患者更多安慰和鼓励，对患者本人及家属的心理健康意义重大。本研究表明，SSE可延缓甚至减少轻度AIS患者的Cobb角和ATR角，从脊柱本身到形体外观使患者获益。
SRS-22量表评价中的治疗满意度显著提高，提示患者对治疗效果的肯定和接受。由于目前对轻度AIS的治疗和矫正重视不足，患者及其家长就诊时常被告知“观察”、“定期复查”，不予任何干预措施，但其一般无法接受仅“观察”这一方案，因此，当给予SSE治疗方案时，患者及其家长在心理上得到较大安慰与信心。此外，患者普遍关注Cobb角和ATR角，虽然本研究中Cobb角和ATR角的减小幅度较小，但就AIS自然进展的病程而言，Cobb角未增加，“剃刀背”未加重，足以获得患者及其家长的认可，治疗满意度明显提高，同时这也是激励患者继续有效训练的动力，只有坚持长期训练，才能取得预期效果，形成良性循环。
量表中运动功能、脊柱疼痛、自我感觉和心理健康4项指标在治疗前后无显著改善，可能与样本量较小且研究对象为轻度AIS有关，轻度AIS对运动功能和脊柱疼痛的影响小。而心理健康评分有下降趋势需引起重视，多数情况下，当发现存在脊柱侧凸时，患者本身并无任何不适，初次确诊时患者对疾病全无认识，填写SRS-22量表时尚处于不了解状态，而在其后的复诊期间，患者进行大量咨询及查阅，逐渐加重对疾病的心理负担，且大多数患者为青少年，情绪易波动，易受外界干扰，故心理健康的评分有所下降。临床工作中需加强对AIS患者的心理干预，良好的心态和依从性是保守治疗有效性的直接保证[22]。
本研究尚存在以下局限性：首先，家庭性自我康复无法得到专业监督，导致SSE效果无法充分体现，建议患者在治疗师监督下进行康复训练，充分发挥SSE效果；其次，由于来我科接受康复训练的患者都愿意接受SSE矫正训练，故未设立对照组，因而本研究无法体现SSE延缓AIS自然进展的程度。
SSE对不同进展阶段的AIS效果不同：(1)年纪较小、度数较轻的侧凸患者脊柱活动度及柔韧性好，脊柱尚无明显结构性畸形，SSE可作为主要矫正手段；(2)随着脊柱侧凸度数的增加，SSE矫正效果减弱，须与支具矫形或其他矫形措施配合使用；(3)必须行支具矫形时，SSE仍为一种必不可少的辅助手段，防止因制动引起的肌肉萎缩及其他废用性改变，预防脊柱僵硬，改善呼吸功能[23]。
本研究证实SSE可延缓甚至改善轻度AIS的进展，为轻度AIS患者的治疗提供新的依据。与传统“观察”方案相比，SSE更适用于目前健康意识大幅提高的患者及家属，是临床上针对轻度AIS患者的有效治疗手段。
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图 2 靶蛋白在大鼠脊髓背角的表达情况
A.pSTAT3；B.STAT3；C.SOCS3；D.JAK2
STAT3：信号转导和转录激活子3；pSTAT3：磷酸化STAT3；SOCS3：细胞因子信号抑制因子3；JAK2：Janus激酶2;Mr:相对分子质量；与对照组比较，*P < 0.05表 1 RT-PCR目的基因引物序列
引物名称 引物序列 STAT3-F 5′-TACCACAAAAGTCAGGTTGCTG-3′ STAT3-R 5′-ACATCCCCAGAGTCCTTATCAA-3′ SOCS3-F 5′-GAGAGCGGATTCTACTGGAGTG-3′ SOCS3-R 5′-GTCACTGCGCTCCAGTAGAAG-3′ JAK2-F 5′-GGTTCATTCAGCAGTTCAGTCA-3′ JAK2-R 5′-GCAGGGTCTCCAGGTTTATG-3′ IL-6-R 5′-TCTTGGGACTGATGTTGTTGAC-3′ IL-6-F 5′-TGGGTGGTATCCTCTGTGAAGT-3′ 
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