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Clinical Characteristics and Genetic Mutations of Chinese Patients with X-linked Retinoschisis
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摘要:目的 探讨中国遗传性视网膜劈裂症(X-linked retinoschisis, XLRS)患者的临床特征及致病基因突变位点。方法 研究纳入北京协和医院眼科经临床确诊的5个XLRS家系(包含12例患者)、10例散发病例、16名女性携带者和100名无眼疾的正常对照者。5个家系的先证者及10例散发病例(共15例患者)接受了详细的眼科检查。采集22例患者及16名携带者的外周静脉血3 ml用于提取基因组DNA。采用聚合酶链反应法对RS1基因的6个外显子片段进行扩增后直接测序, 以明确突变位点及突变类型。结果 RS1基因检测共发现11种致病性突变, 包括p.E72K、p.W92C、p.R102Q、p.W112X、p.S134P、p.R156G、p.P193S、p.R200H、p.R209C、p.R213W和p.R213Q, 其中p.W112X和p.S134P突变为新发突变。1例散发病例未确定RS1基因突变位点。在确定突变的所有患者中, 5个家系的先证者和9例散发患者主诉均为不同程度的视力下降, 最佳矫正视力在0.04~0.8之间。眼底检查均存在特征性黄斑区劈裂, 其中有6例患者合并周边视网膜劈裂。携带RS1基因突变的患者中有10例接受视网膜电图检查, 结果显示9例患者的混合反应均呈特征性的负波形。携带同一致病性突变的不同患者病情轻重程度有所不同。结论 XLRS患者在临床表型上存在较大差异, 未观察到基因型与表型间的相关性。Abstract:Objective To assess the clinical features and to identify genetic mutations in Chinese patients with X-linked retinoschisis (XLRS).Methods Patients were recruited from ophthalmic clinics in Peking Union Medical College Hospital. A cohort of five unrelated XLRS families (including 12 XLRS patients), 10 sporadic XLRS patients, 16 female carriers and 100 normal subjects were enrolled in this study. Clinical evaluation was performed on all probands from 5 unrelated families and 10 sporadic cases involved in this study (15 patients in total). Genomic DNA was extracted from the peripheral leukocytes of 22 patients and 16 carriers. All exons and the flanking introns of the RS 1 gene were amplified by polymerase chain reaction and screened for mutations by direct DNA sequencing.Results A total of 11 mutations including p. E72K, p. W92C, p. R102Q, p. W112X, p. S134P, p. R156G, p. P193S, p. R200H, p. R209C, p. R213W and p. R213Q were identified, among which p. W112X and p. S134P were two novel mutations. We did not find any mutation in one sporadic case. Clinical evaluation on patients with RS1 mutation (14 patients in total) showed that reduced visual acuity was the common initial symptom in all 14 patients. The best corrected visual acuity ranged from 0.04 to 0.8. Typical foveal schisis was found in all 14 patients, among whom 6 were found to be with peripheral schisis. Electroretinogram was carried out on 10 patients with RS1 gene mutations and 9 of them displayed electronegative in the standard combined response. Patients with same RS1 mutation exhibited remarkable phenotypic differences.Conclusions Chinese patients with XLRS displayed variability in clinical phenotypes. No association was found between the genotypes and phenotypes.
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Keywords:
- X-linked retinoschisis /
- RS1 gene /
- mutation /
- phenotype
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遗传性视网膜劈裂症(X-linkedretinoschisis, XLRS)是引起青少年男性黄斑部病变的主要原因, 在全球范围内的患病率约为1:25000~1:5000[1]。该病以视网膜黄斑区微囊样车轮状改变伴内层视网膜的劈裂为主要特征, 劈裂通常位于视网膜神经纤维层。约有半数患者会合并周边视网膜劈裂, 一般位于颞下方视网膜[2-4]。多数患者视网膜电图(electroretinogram, ERG)呈现典型的负波形, 即在混合反应中, b波振幅明显减低致使b/a比值下降[1]。该病患者通常在幼年时起病, 疾病缓慢进展, 同时可合并出现玻璃体积血、视网膜脱离, 部分患者会出现新生血管性青光眼等严重并发症, 引致患者的视力严重下降[5-7]。
XLRS的相关致病基因RS1定位于X染色体的短臂[8]。该基因由6个外显子组成, 编码一段由224个氨基酸构成的分泌性蛋白, 称为RS1蛋白(retinoschisin)。该蛋白主要表达于视网膜光感受器细胞及双极细胞的表面, 参与调节细胞间的黏附及信号传递, 对维护视网膜正常的结构及功能具有重要作用[9-10]。RS1蛋白主要包含两个保守性结构域, 分别为位于蛋白N-端的信号肽区(由外显子1~2编码)及高度保守的盘状结构域(由外显子4~6编码)。信号肽区主要参与调控蛋白由内质网向胞浆的正常分泌, 而盘状结构域主要与蛋白的黏附功能相关[11-12]。
尽管RS1基因相对较小, 但迄今为止已发现超过100种致病性突变与XLRS相关。目前已报道的RS1基因突变位点绝大多数位于由外显子4~6编码的RS1蛋白的盘状结构域(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/ index.php)。本研究针对14例中国XLRS患者进行表型特征分析, 对相关致病基因RS1进行突变筛查, 并初步探讨该病基因型和表型的相关性。
对象和方法
研究对象
本研究共纳入临床确诊的5个XLRS家系(图 1)及10例散发XLRS患者(家系/患者编号XLRS-A~ O)、16名女性携带者和100名无眼疾的正常对照者。5个家系共包含12例患者。患者及正常对照者均来自北京协和医院眼科, 女性携带者来自患者家系。本研究经北京协和医院伦理委员会批准, 研究过程遵循赫尔辛基宣言, 参与研究的患者、亲属或其法定监护人均签署知情同意书。
临床研究方法
来自5个家系的先证者及10例散发患者(共15例患者)接受了系统详尽的眼科检查, 包括最佳矫正视力、裂隙灯、间接检眼镜、光学相干断层扫描(optical coherence tomography, OCT)以及ERG检查。ERG检查采用国际临床视觉电生理学会(International Society for Clinical Electrophysiology of Vision, ISCEV)标准。
分子遗传学研究方法
采集22例患者和16名女性携带者的外周静脉血, 提取基因组DNA (Qiagen, Hilden, Germany)。通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增RS1基因的全部6个外显子及相应的外显子内含子结合处, 引物序列参照文献报道[13]。PCR产物纯化后, 应用ABI3730自动测序仪(ABI, FosterCity, CA, USA)进行正反向测序。基因序列通过Lasergene SeqMan软件进行分析, 并与RS1标准序列进行比对(GeneBank accession number:NM_000330)。发现改变后，若为新发突变，则选取100名无血缘关系的正常对照进行验证，以排除是否为未知的多态位点。
结果
基因检测
22例XLRS患者中共发现11种RS1基因致病性突变(表 1), 其中10种为错义突变, 1种为无义突变。研究共发现2种新发突变, 分别为p.W112X和p.S134P(图 2)。所有突变位点均集中位于编码RS1蛋白盘状结构域的RS1基因外显子4~6。散发病例XLRS-O并未检测到携带RS1基因突变。
表 1 DNA测序检测到的RS1基因突变
临床表型分析
携带RS1基因突变的14例患者的就诊年龄为6~ 39岁, 其主要始发症状均为不同程度的视力下降, 最佳矫正视力为0.04~0.8。家系XLRS-H的先证者左眼为人工晶体眼, 其余患者眼前节检查均无明显异常。患者眼底表现较为相似, 所有患者眼底及OCT检测均提示有视网膜黄斑区囊样劈裂, 但劈裂囊腔的大小随年龄改变明显, 年龄较小的患者眼底黄斑区可以观察到明显的劈裂囊腔, 而年长的患者更多表现为眼底萎缩性改变(图 3)。本研究纳入的所有患者中, 有6例患者同时合并周边视网膜劈裂, 3例患者因并发性视网膜脱离需进行网脱复位手术治疗(表 2)。未检测到携带RS1基因突变的散发病例XLRS-O为一男性患者, 无高度近视, OCT检测结果提示患者存在双眼黄斑区劈裂(图 4)。携带RS1基因突变的14例患者中有10例接受ERG检测, 其中9例患者混合反应呈现典型的负波形。携带同一致病性突变的不同家系患者的临床表型可有较大差别(图 5), 未观察到基因型与表型间的相关性。
表 2 携带RS1基因突变的14例患者临床资料
讨论
本研究对纳入的22例XLRS患者进行RS1基因检测, 共发现11种RS1基因致病性突变, 其中2种为新发突变。所有突变均位于RS1基因的外显子4~6, 该区域编码RS1蛋白的盘状结构域。盘状结构域与RS1蛋白的黏附功能密切相关, 是维持视网膜结构及建立正常突触连接的关键。以往研究发现位于该结构域的错义突变所致突变型RS1蛋白不能正常折叠和分泌, 过多异常折叠的蛋白堆积在内质网造成内质网危机, 引发未折叠蛋白反应, 从而导致细胞过早凋亡[14]。
散发病例XLRS-O的OCT检查结果提示患者存在双眼黄斑区劈裂, 结合患者自幼视力下降的病史, 诊断为XLRS; 但RS1基因检测结果并未确定患者所携带的基因突变位点。推测其可能原因是, 患者也许携带某种类型的RS1基因突变, 如外显子区的大片段缺失、内含子区可能影响前体mRNA剪切的突变以及一些位于基因调控区域的突变等, 通过本研究所采用的检测方法无法检测出。
根据以往的文献报道, RS1蛋白中涉及半胱氨酸残基的突变最为常见[15], 而本研究却发现有6种突变涉及精氨酸残基, 其中患者C、D、H、I和M的突变均涉及213位精氨酸, 提示该位点可能为突变热点。家系C和D为第6外显子上第637位碱基由C突变为T, 引起错义突变导致蛋白第213位精氨酸转变为色氨酸, 家系H、I和M则在第6外显子的第638位碱基由G突变为A, 引起错义突变导致蛋白第213位精氨酸转变为谷氨酰胺, 以上两种突变均导致蛋白质氨基酸残基的改变, 进而导致RS1蛋白功能的改变或缺陷而发病。
本研究所观察的携带RS1基因突变的14个XLRS家系在临床表型上存在较为明显的差异, 14例患者最佳矫正视力差别较大, 黄斑区劈裂囊腔的大小随年龄改变明显。此外, 研究者对家系H的先证者进行了长达32年的跟踪随访, 在整个随访观察期内, 患者曾合并出现玻璃体出血、白内障等并发症, 在进行了积极的药物、激光及手术治疗后, 患者的视力可以保持较为稳定的状态, 提示XLRS是一种缓慢进展的遗传性视网膜疾病, 这与以往的文献报道相似[16-17]。
本研究发现携带同一致病性突变的不同家系, 家系中患者的临床表型差别较大。如家系C和家系D均携带错义突变p.R213W, 两个家系的先证者年龄相似, 但临床表型却有较为明显的差别。与家系D的先证者相比, 家系C的先证者有较好的中心视力, 眼底表现也更为轻微, 仅有黄斑区劈裂。而在以往的文献报道中, 携带R213W突变的XLRS患者其临床表型存在较大的差异[18-19], 提示XLRS的临床表型的严重程度并非仅仅由基因型决定, 可能存在影响疾病表型的其他修饰/调节基因或环境因素。但由于本研究纳入的病例数相对较少, 且有4例先证者未行ERG检测, 因此无法对ERG改变与基因型进行相关性分析, 后续研究中需进一步扩大样本量, 以明确RS1基因型与临床表型之间的相关性。
近年来随着分子生物学技术的迅猛发展，遗传学研究在医学领域的重要性也日益凸显。一方面，遗传学研究可以为疾病的确诊提供分子生物学依据并为患病家系进行遗传咨询；另一方面，深入开展遗传学研究可以进一步明确疾病发生的病理机制并探寻新的治疗手段。对于XLRS而言, 目前在临床上并没有很好的治疗方法, 而通过分子遗传学研究, 确定RS1基因某些截短突变及位于信号肽区的突变可以导致相应功能蛋白的缺失, 这就提示通过基因治疗的方法导入外源野生型基因片段也许会成为治疗XLRS的有效手段。但是到目前为止, 有关不同RS1基因突变类型对蛋白功能的影响研究有限, 进一步的探索也许可以带来XLRS基因治疗的光明前景。
致谢: 衷心感谢参与本次试验研究的所有患者及其亲属的理解及配合。 -
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