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Application of Extended-release Local Anesthetics Based on Composite Polymer Materials in an Animal Model of Chronic Pain
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摘要:目的 对复合多聚体材料组成的局麻药缓释载体的药物释放特征和镇痛效果进行测评。方法 使用静电纺丝技术制备含盐酸布比卡因的PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)缓释膜(静电纺丝膜, M组), 并以PLGA-PEG(聚乙二醇)-PLGA温敏凝胶包裹纺丝膜制备成含盐酸布比卡因的缓释递送系统(凝胶包裹静电纺丝膜形成的复合缓释载体, G组), 评定两组体外释放特征、体内镇痛效果及安全性。结果 体外条件下, M组对盐酸布比卡因的累积释放时间可达5 d以上, G组累积释放时间可延长至10 d。体内条件下, M组和G组对坐骨神经慢性压迫损伤大鼠模型的镇痛时间均可达14 d, 两组镇痛效果无显著差异(P＞0.05)。M组盐酸布比卡因血药浓度在术后第1天达峰值[(0.294±0.029)μg/L], G组于术后第3天达峰值[(0.192±0.064)μg/L], 且峰值较M组降低, 两组盐酸布比卡因血药浓度均在安全范围内。HE染色示, M组、G组大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏组织均未见明显病理改变。结论 本研究制备的以盐酸布比卡因纳米纺丝缓释膜为基础, PLGA-PEG-PLGA温敏凝胶包裹为介质的复合缓释材料, 可进一步延长盐酸布比卡因缓释时间, 具有长效镇痛效果且无毒性作用。Abstract:Objective To evaluate the release characteristics and analgesic effect of extended-release composite polymers of local anesthetics.Methods Polymer extended-release film containing bupivacaine hydrochloride was prepared via electrospinning (nanomembrane, group M), and was furthermore loaded intoPLGA-PEG-PLGA thermo-sensitive gel forming composite extended-release carrier (group G). The in vitro release profile, analgesic effect and safety in vivo were evaluated.Results In vitro, the cumulative release of bupivacaine hydrochloride reached more than 5 d in the group M and 10 d in the group G. In vivo, the analgesic effect in the model of chronic compression injury of sciatic nerve lasted for 14 d in the group M and group G. There was no significant difference between the two groups (P > 0.05). The peak plasma concentration of bupivacaine hydrochloride in the group M was (0.294±0.029)μg/L one day after drug administration, while (0.192±0.064)μg/L in the group G three days after drug administration, which were far below the toxic plasma level of bupivacaine chloride. Meanwhile, there were no significant pathological changes in the heart, liver, spleen, lung and kidney of the two groups.Conclusions In this study, the composite extended-release drug delivery prepared by bupivacaine hydrochloride electrospinning film as the basis and PLGA-PEG-PLGA thermo-sensitive gel can further prolong the release time of bupivacaine chloride and exhibit long-term analgesic effect without toxicity.
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随着医疗理念的更新，作为第五大生命体征的“疼痛”受到越来越多的重视[1]。慢性疼痛不仅增加医疗资源的消耗，甚至会导致劳动力的丧失[2]。阿片类药物在传统镇痛中占据重要地位[3]，但不容忽视的副作用极大限制了其临床应用[4-5]。非阿片类药物已成为世界卫生组织推荐的癌痛镇痛“三阶梯”治疗临床镇痛的首选药物[6]。局麻药是非阿片类药物的重要组成部分，按照镇痛的时间可分为短效、中效、长效局麻药，临床常用的盐酸布比卡因和罗哌卡因均为长效局麻药。但此类传统局麻药半衰期短，即使是长效局麻药，其镇痛时间也仅能维持4 h[7]。大剂量使用局麻药或局麻药不慎入血后，还可引发心脏、大脑等全身毒性反应[8]。
为克服传统局麻药的缺点，各类基于缓释载体的长效局麻药相继问世[9-11]。作为第一个被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准的局麻药缓释制剂，EXPAREL(Pacira Pharmaceuticals, Parsippany, New Jersey, USA)依赖脂质体的缓释作用，实现了布比卡因在体72 h的镇痛效果[12]。但EXPAREL亦存在明显的局限性，如由于脂质体的强流动性，不同手术中镇痛效果不稳定；EXPAREL使用20 min内禁用其他局麻药；脂质体与盐酸布比卡因溶液混合使用比例(需＞20∶1)不当时易引发安全问题[13]。
静电纺丝技术制备的多聚体缓释载体具有较好的稳定性和安全性[14]。既往研究证明，PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)静电纺丝缓释膜在体外能实现约30 d缓释，同时将局麻药的镇痛时间延长至5 d[9]，但体内外缓释镇痛效果存在明显差异，其在慢性痛动物模型中的镇痛效果尚需验证。既往研究表明，三嵌段PLGA-PEG(聚乙二醇)-PLGA温敏凝胶包裹多聚体纳米颗粒可进一步延缓药物释放效果，延长多聚体载体在体内的缓释时间[15]。本研究通过静电纺丝技术制备含盐酸布比卡因的纳米纺丝缓释膜，进一步通过温敏凝胶包裹形成复合缓释载体，对该复合缓释载体的材料学性质、药物体外释放特征、体内镇痛效果以及局部和系统毒性进行评估。
1. 材料与方法
1.1 动物
雌性SD大鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，7周龄，体质量约180 g。
本研究已通过中国医学科学院基础医学研究所伦理审查委员会审批(审批号：#211-2014)。
1.2 主要材料与仪器
PLGA(中国AbMole公司)；三嵌段PLGA-PEG-PLGA温敏凝胶(杭州新乔生物科技有限公司)；盐酸布比卡因(中国AbMole公司)；六氟异丙醇(1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoro-2-propanol，HFIP)(中国麦克林公司)；静电纺丝设备(天津云帆科技有限公司)；MERLIN Compact超高分辨率场发射扫描电镜(德国ZEISS公司)；Agilent 1260 Infinity Ⅱ液相色谱系统(美国Agilent Technology公司)；电子von Frey测试仪(美国IITC生命科学公司)。
1.3 研究方法
1.3.1 静电纺丝膜制备
以HFIP为溶剂，质量体积比(w/v)分别为15∶100(15%)、20∶100(20%)、25∶100(25%)以及30∶100(30%)溶解PLGA[16-18]。室温(26 ℃)搅拌约12 h后获得无色透明且具有一定黏稠度的均质溶液。按质量质量比(w/w)35∶100(35%) 向溶液中加入盐酸布比卡因粉末，搅拌4 h获得无色透明均质溶液。将上述溶液载入静电纺丝设备的供液泵中，调节正、负极电压，保持电压1 kv/cm。以0.001 mm/s的推注速度将溶液推出，形成的纺丝以膜的形式收集于低速旋转接收器中。
1.3.2 温敏凝胶制备
以w/v为25∶100(25%)的PBS溶解PLGA-PEG-PLGA，室温(26 ℃)下静置过夜，获得澄清透明溶液并置于37 ℃摇床升温，用于后续制备温敏凝胶。
1.3.3 扫描电子显微镜显像
将收集的纺丝粘贴于金属载物盘，并予以蒸涂金导电膜。15 kV加速电压下，扫描电子显微镜下观察并测量纺丝直径、形态与纺丝膜厚度。
1.3.4 体外释放实验
将纺丝膜随机分为静电纺丝膜组(M组)、凝胶包裹静电纺丝膜形成的复合缓释载体组(G组)。(1)M组：将一定质量的纺丝膜置于透析袋中(透过分子质量为3500道尔顿)，于透析袋中注入1 mL PBS浸没纺丝膜，并用缝线结扎透析袋两端，悬吊并置于含10 mL PBS的50 mL离心管中。(2)G组：将w/v为1∶1000混合的纺丝膜与温敏凝胶溶液置于50 mL离心管中，升温, 将温敏凝胶转化为固态并包裹纺丝膜，制备完成后向离心管中加入10 mL PBS。
将上述离心管置于恒温震荡仪中，37 ℃ 30 r/min匀速转动。分别于30 min、1 h、2 h、3 h、6 h及1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、10 d、14 d时取200 μL离心管中的溶液于EP管中(并分别向离心管中补充200 μL新鲜PBS[19])，-20 ℃冰箱保存备用。采用高效液相色谱法测量上述不同时间点样品中盐酸布比卡因浓度(检测波长210 nm[17])。根据标准品盐酸布比卡因浓度曲线，计算该时刻盐酸布比卡因释放率。
1.3.5 动物行为学实验
1.3.5.1 坐骨神经慢性压迫损伤模型制备
大鼠均腹腔注射戊巴比妥钠(1%，0.3 mL/kg)麻醉，于大鼠右侧大腿根部作一长1.5 cm切口，钝性分离股二头肌并暴露坐骨神经。于坐骨神经主干处由近心端至远心端用4-0缝合线结扎3道，每道间隔0.5 mm，结扎程度以恰好引起肌颤或肢体轻微运动为宜，以制备慢性痛模型[20]。缝合肌肉与皮肤，医用酒精消毒伤口。
1.3.5.2 组间处理
18只大鼠随机分为正常对照组(NC组)、M组、G组各6只。NC组仅结扎坐骨神经而不作给药处理。M组、G组术中分别在坐骨神经结扎处加入1 mg的静电纺丝膜、等量凝胶包裹静电纺丝膜形成的复合缓释载体。
1.3.5.3 机械痛阈值测量
分别于术前及术后1 d、3 d、7 d、14 d测量3组大鼠机械痛阈值。测量前将大鼠独立置于测试笼中适应30~60 min。测试时，将电子von Frey仪的针头垂直置于大鼠手术侧后足脚掌距脚跟约1 cm处，缓慢抬升至大鼠迅速抬起脚掌但无发声或针头弯曲时停止，记录仪器示数[21]；同样方法测量对照侧(未手术侧)。间隔5 min后再次测量，3次测量的均值为大鼠机械痛阈值。
1.3.6 血药浓度检测
分别于术后1 d、3 d、7 d、14 d，取G组和M组大鼠尾静脉(每组随机取3只大鼠)全血1 mL置于EDTAK2抗凝管。4 ℃，离心半径19 cm，10 000 r/min离心15 min。取上层血浆于EP管中，采用液相色谱-质谱联用法测量血浆盐酸布比卡因浓度[22]。
1.3.7 器官/组织毒性实验
术后14 d，处死大鼠，取其心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏任意部分组织或具有明显病变的组织，置于4%的组织固定液中，进行石蜡包埋切片及HE染色。10×10倍显微镜下观察器官/组织水肿、坏死或细胞损伤等情况。
1.4 统计学处理
采用GraphPad Prism 9.1.1软件进行统计学分析和图表绘制。血药浓度符合正态分布，以均数±标准差表示，机械痛阈值、血药浓度的组间比较采用重复测量方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 纺丝膜与温敏凝胶形态特征
纺丝膜外观呈白色、光滑、质地均匀。扫描电子显微镜示，以15% w/v溶解于HFIP的PLGA纺丝直径不均一，且有明显肿胀和液滴附着(图 1A)；以20% w/v溶解于HFIP的PLGA纺丝表面光滑，直径分布亦不均匀(图 1B)；以25% w/v溶解于HFIP的PLGA纺丝表面光滑，质地均一，无明显缩窄、肿胀、晶体颗粒析出，直径约为3 μm(图 1C)；以30% w/v溶解于HFIP的PLGA纺丝亦未无明显缩窄、肿胀和液滴附着，直径约为3~4 μm(图 1D)。
室温下，PLGA-PEG-PLGA水凝胶溶液呈澄清、微蓝色、透明牛顿流体；于恒温振荡器中升温至37 ℃，液体逐渐转变为无色、透明凝胶非牛顿流体，具有一定强度(图 2)。
2.2 缓释膜体外释放特征
体外条件下，开始释放30 min时，M组对盐酸布比卡因的释放率为31.12%，G组释放率为37.80%，两组盐酸布比卡因累积释放率均于1 h后达50%。此后M组释放率呈快速上升的趋势，释放1 d时达平台期，累积释放率接近100%，累积释放时间可达5 d以上；G组累积释放时间可达10 d(图 3)。
2.3 大鼠机械痛阈值
与术前比较，术后1 d时大鼠机械痛阈值无显著变化，术后3 d时出现显著降低，且于术后7 d时达最低点。3组大鼠术前机械痛阈值均无显著差异(P均＞0.05)。相较NC组，M组和G组大鼠术后3 d、7 d、14 d机械痛阈值显著提高(P均＜0.05)；相较M组，G组术后1 d、3 d、7 d、14 d机械痛阈值均无显著变化(P均＞0.05)，见图 4。
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图 4 3组大鼠模型机械痛阈值变化折线图*M组与NC组比较，P＜0.05；ζM组与NC组比较，P＜0.001；#G组与NC组比较，P＜0.05； & G组与NC组比较，P＜0.001；NC：正常对照; M、G：同图 32.4 血药浓度
M组盐酸布比卡因血药浓度在术后第1天达峰值[(0.294±0.029)μg/L]，G组于术后第3天达峰值[(0.192±0.064)μg/L]，G组血药浓度峰值低于M组，且两组盐酸布比卡因血药浓度峰值均在安全范围内。两组术后1 d、3 d、7 d、14 d血药浓度均无显著差异(P＞0.05)，见图 5。
2.5 器官/组织毒性
术后14 d，NC组、M组和G组大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏组织大体观均未见明显病变，HE染色后显微镜下观察，与NC组比较(图 6A、6D、6G、6J、6M)比较，M组(图 6B、6E、6H、6K、6N)和G组(图 6C、6F、6I、6L、6O)均未见明显的结构紊乱、细胞肿胀、破裂、萎缩等异常改变。
3. 讨论
慢性疼痛中，以神经病理性疼痛较常见。国际疼痛联合研究协会(International Association for the Study of Pain, IASP)将神经病理性疼痛定义为由于躯体感觉系统发生损伤或疾病导致的疼痛，其典型症状为痛觉敏化、痛觉过敏，部分患者伴长期进行性自发或触诱发痛，以及疼痛感觉异常[23]。神经压迫、糖尿病、神经瘤、离子通道相关病变、心血管疾病以及自身免疫病等均可诱发神经病理性疼痛。目前，临床用于治疗神经病理性疼痛的注射剂或口服常速释放剂型药物如三环类抗抑郁药、普瑞巴林、加巴喷丁、五羟色胺-去甲肾上腺素重摄取抑制剂以及阿片类镇痛药存在作用时间短、毒副作用较大等不足，因此，缓释镇痛药的研究与开发显得尤为重要。
作为人工合成的生物可降解高分子材料，PLGA具有良好的生物相容性，体内降解产物水和二氧化碳安全性高，因此，广泛应用于再生医学以及药物递送系统[24]。本研究采用单纯混合的方式(以HFIP为溶剂，w/v为25∶100)将局麻药布比卡因包裹于PLGA中以制备骨架溶蚀型静电纺丝膜，形态特征符合预期，纺丝表面光滑、质地均一，随着PLGA与体液接触后发生降解，药物得到逐步释放，具有缓释的特点。
由于药物会在高分子溶液表面形成正吸附现象，因此纺丝表面存在未完全包裹于材料的游离药物，同时材料接触液体环境后，由于液体可进入载体孔道，部分药物会首先被冲洗而出，造成药物的突释现象。本研究将静电纺丝膜包裹于PLGA-PEG-PLGA水凝胶中，发挥缓冲作用；药物从纺丝中释放后首先进入凝胶层，随着凝胶层的逐渐降解后才向作用部位释放，一定程度上延缓了药物释放，缓解了药物的突释现象(图 3)。此外作为嵌段共聚物，水凝胶中的PEG片段增加了材料的亲水性，与单纯通过疏水性PLGA静电纺丝给药比较，凝胶状态随温度变化而发生转变，室温下呈液态，正常体温下呈胶凝态，可增加药物递送载体的组织相容性和依从性，且满足临床需求。本研究体外释放特征数据显示，开始释放时，静电纺丝膜组(M组)和凝胶包裹静电纺丝膜形成的复合缓释载体组(G组)对盐酸布比卡因具有类似的释放率(31.12%比37.80%)，但释放1 h后M组释放率加快，累积释放时间在5 d以上；而G组累积释放时间可达10 d(图 3)，提示凝胶包裹延长了静电纺丝缓释内的药物释放时间。由于高分子材料在体内的降解受机体生理环境的影响，因此药物释放速率远低于体外释放。本研究结合大鼠机械痛阈值改变数据后认为，M组和G组药物在体内的释放时间均可达14 d，再次验证了该镇痛药物缓释载体的缓释镇痛效果(图 4)。
本研究未观察到复合缓释体相较单一静电纺丝膜在缓解疼痛方面更具优势，分析原因如下：(1)首先，体外条件下仅观察到最长4 d的盐酸布比卡因缓释效果，未涵盖该模型疼痛最剧烈的时间点(术后第7天)，可能因二者缓释时长受限造成镇痛效果无明显差异，这亦凸显了超长效镇痛药物的应用价值。(2)神经病理性疼痛的发生机制不仅与疼痛刺激诱发感觉神经兴奋信号的传入有关，还受炎症因子、胶质细胞激活等因素的调控，即使在缓释时间充分的情况下，单一镇痛药物对该类疼痛的镇痛效果亦可能不佳。因此，开发多种药物复合的缓释药物载体成为一种新趋势。
由于PLGA与局麻药均可引起局部炎症反应，导致组织损伤[8, 25-26]。本研究进一步比较了静电纺丝膜和复合缓释载体对大鼠重要脏器的影响，HE染色结果显示上述器官均未发生明显的病变和坏死(图 6)。结合药物的血药浓度数据，M组和G组术后1 d、3 d、7 d、14 d的盐酸布比卡因血药浓度整体呈较为统一的变化趋势，即于释放初期达峰值，随后缓慢降低(G组后期出现小范围升高)，但血药浓度一直维持在极低范围内(图 5)，远低于文献报道的最小致毒血药浓度1000 μg/L[27]。提示，静电纺丝膜和复合缓释载体对大鼠无毒副作用。与M组比较，G组的血药浓度峰值更低，提示凝胶包裹含盐酸布比卡因的静电纺丝可提高其生物安全性。
综上，采用静电纺丝技术，本研究首次制备了以盐酸布比卡因纳米纺丝缓释膜为基础，PLGA-PEG-PLGA温敏凝胶包裹为介质的复合缓释材料。该复合缓释材料进一步延长了镇痛药物的缓释时间，显示出长效的镇痛效果，且体内使用无明显毒性作用。该药物缓释体系为局麻药等镇痛药物的递送提供了新思路，丰富了镇痛药物的给药形式，为慢性疼痛的临床治疗提供了新的技术支持。未来研究可进一步探究纺丝和凝胶的混合方式以及用量配比，进一步优化给药条件，使镇痛效果最大化。
作者贡献：孙丰润、李默晗负责实验实施、数据处理和论文撰写；贺渝淼、王涛负责实验设计、实验指导和论文修订；马超、黄宇光负责研究设计、论文修订与审核。利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突 -
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图 4 3组大鼠模型机械痛阈值变化折线图
*M组与NC组比较，P＜0.05；ζM组与NC组比较，P＜0.001；#G组与NC组比较，P＜0.05； & G组与NC组比较，P＜0.001；NC：正常对照; M、G：同图 3
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