一种寨卡病毒富集检测方法的性能评价

李阿茜, 孔令君, 刘洋, 伊洁, 李川, 梁米芳, 窦亚玲

李阿茜, 孔令君, 刘洋, 伊洁, 李川, 梁米芳, 窦亚玲. 一种寨卡病毒富集检测方法的性能评价[J]. 协和医学杂志, 2022, 13(3): 455-460. DOI: 10.12290/xhyxzz.2021-0357
引用本文: 李阿茜, 孔令君, 刘洋, 伊洁, 李川, 梁米芳, 窦亚玲. 一种寨卡病毒富集检测方法的性能评价[J]. 协和医学杂志, 2022, 13(3): 455-460. DOI: 10.12290/xhyxzz.2021-0357
LI Aqian, KONG Lingjun, LIU Yang, YI Jie, LI Chuan, LIANG Mifang, DOU Yaling. Evaluation of an Assay of Zika Virus Detection Without RNA Extraction[J]. Medical Journal of Peking Union Medical College Hospital, 2022, 13(3): 455-460. DOI: 10.12290/xhyxzz.2021-0357
Citation: LI Aqian, KONG Lingjun, LIU Yang, YI Jie, LI Chuan, LIANG Mifang, DOU Yaling. Evaluation of an Assay of Zika Virus Detection Without RNA Extraction[J]. Medical Journal of Peking Union Medical College Hospital, 2022, 13(3): 455-460. DOI: 10.12290/xhyxzz.2021-0357

一种寨卡病毒富集检测方法的性能评价

基金项目: 

北京市临床重点专科医学检验科卓越项目 ZK201000

详细信息
    通讯作者:

    窦亚玲, E-mail: hellodyl66@163.com

  • 中图分类号: R373

Evaluation of an Assay of Zika Virus Detection Without RNA Extraction

Funds: 

Beijing Key Clinical Specialty for Laboratory Medicine-Excellent Project ZK201000

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  • 摘要:
      目的  对一种无需核酸提取纯化的寨卡病毒实时荧光定量反转录PCR检测方法的性能进行评价。
      方法  该检测方法基于实时荧光定量反转录PCR技术, 样本处理采用病毒富集法: 取100~200 μL待测样本, 加入112~224 μL样本处理液Ⅰ, 5~10 μL样本处理液Ⅱ, 混匀后进行离心富集(12 000 r/min, 离心半径8.6 cm, 离心5 min)。离心后弃上清液, 加入20 μL复溶缓冲液重悬沉淀; 取10 μL重悬液, 加入50 μL PCR反应液上机检测。从定量检测下限、交叉反应、抗干扰性、精密度方面评价该检测方法的性能。收集北京协和医院检验科临床样本(血清、尿液、唾液样本), 随机选取约1/5构建寨卡病毒感染模拟临床样本, 进一步评定该检测方法的性能。
      结果  该检测方法对MR766、ZKC2/2016毒株的检测下限均为101半数组织培养感染剂量(50% tissue culture infective dose, TCID50)/mL; 对17种常见虫媒病原体检测结果均为阴性, 无交叉反应发生; 潜在干扰物质胆红素(15 mg/L)、血红蛋白(100 mg/L)、甘油三酯(2000 mg/L)、IgG(37.5 g/L)和EDTA-Na2(2.5 g/L)对其检测结果无干扰; 检测低、中、高浓度寨卡病毒的批次内和批次间Ct值变异系数均<10%, 精密度良好。共收集344份北京协和医院检验科临床样本, 其中构建寨卡病毒感染模拟临床样本73份。采用该检测方法对344份样本进行检测, 结果均与实际相符, 无假阳性和假阴性。
      结论  寨卡病毒简单富集后再检测的方法特异性高、重复性好, 检测结果不受干扰物质的影响, 检测下限满足临床需求, 且操作简便, 但应用效果仍需在真实临床样本中进一步验证。
    Abstract:
      Objective  To evaluate a Zika virus(ZIKV) test based on real-time reverse-transcriptase-polymerase chain reaction (rRT-PCR) that can be performed without RNA isolation.
      Methods  The detection method is based on rRT-PCR technology, and a virus-enrichment method is used for sample processing. The sample processing procedure is: Add 112-224 μL sample treatment solution Ⅰ and 5-10 μL sample treatment solutionⅡ to 100-200 μL clinical samples, vortex and then centrifuge at a speed of 12 000 r/min and a centrifugation radius of 8.6 cm for 5 minutes. After centrifugation, discard the supernatant, add 20 μL of solution to resuspend the precipitate, and then add 10 μL of the resuspended precipitate into the PCR reaction solution(50 μL) for detection. The performance of the assay was evaluated from the aspects of the lower limit of detection, cross reactions, interfering substances and precision. Clinical samples (serum, urine and saliva samples) were collected from the Clinical Laboratory of Peking Union Medical College Hospital, and 1/5 of these samples were randomly selected to simulate clinical samples of ZIKV infection to further evaluate the performance of the method.
      Results  The lower limit of detection(LOD) of the ZIKV assay for MR766 and ZKC2/2016 strains was 101 50% tissue culture infective dose(TCID50)/mL. A panel of 17 potential cross substances was tested and no cross-reactivity was detected. Potential interfering substances including bilirubin (15 mg/L), hemoglobin (100 mg/L), triglycerides (2000 mg/L), IgG (37.5 g/L) and EDTA-Na2(2.5 g/L) were evaluated and no obvious interference was observed. The intra-lots and inter-lots variations that were measured by coefficient of variation (CV), were lower than 10%. A total of 344 clinical samples from the Clinical Laboratory of Peking Union Medical College Hospital were collected; 73 simulated clinical samples of ZIKV infection were constructed. The detection results of 344 samples by this method were consistent with the expected results without false positives and false negatives.
      Conclusions  The detection method for ZIKV has good specificity and repeatability. The detection results are not affected by interfering substances. The LOD meets clinical requirements, and the operation is simple. It can be used as a backup diagnostic tool for ZIKV and it needs to be further verified in real clinical samples.
  • 孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)简称孤独症,是一组发病于儿童早期的神经发育障碍性疾病,其主要特征为社交沟通障碍、兴趣狭隘和重复刻板行为[1]。除神经系统症状外,ASD患儿亦存在许多共患病,特别是便秘、腹痛等胃肠道症状高发,提示其存在胃肠道功能失调[2],且有证据表明ASD患儿的胃肠道问题与神经精神症状严重程度显著相关[3]。虽然目前ASD的病因尚不明确,但肠道菌群在ASD发病中的作用近年来受到高度关注[4]。肠道微生态重建对ASD的核心症状和胃肠道症状均具有明显改善作用,进一步支持肠道菌群紊乱可能是ASD的重要潜在发病机制之一[5]

    维生素D是人体内重要的微量元素,除调节钙磷代谢进而影响骨骼健康外,活性维生素D还可通过维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)发挥调节代谢和免疫系统的作用[6],VDR不仅存在于多种免疫细胞[7],亦在小肠和结肠中高表达[8]。肠道菌群通过调节维生素D的吸收和羟化,与维生素D相互影响,维持肠道黏膜稳态[9]

    ASD患儿普遍存在维生素D缺乏情况,研究发现补充维生素D可改善ASD患儿的临床症状[10]。为进一步研究维生素D缺乏对ASD患儿肠道菌群的影响,本研究将探讨ASD患儿维生素D正常与缺乏状态下的肠道菌群差异,以及血清总25-羟维生素D[total 25-hydroxyvitamin D,T-25(OH)D]水平与肠道菌群的相关性。

    回顾性收集2019年10月至2022年2月于北京协和医院风湿免疫科门诊就诊的1~12岁ASD患儿临床资料。纳入标准:由经验丰富的临床医生采用美国精神病学会发布的精神疾病诊断统计手册第五版(Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders-fifth edition,DSM-5)[11]ASD诊断标准,以及儿童孤独症评定量表(childhood autism rating scale,CARS) 对患儿进行评估,明确诊断为ASD。排除标准:(1)同时诊断为其他神经精神疾病或严重躯体性疾病;(2)粪便采样前1个月内使用各类抗生素及其他对肠道微生物有影响的药物或干预措施;(3)血清T-25(OH)D检测前近3个月内补充维生素D治疗;(4)血清T- 25(OH)D检测和粪便样本采样时间间隔超过14 d;(5)病史资料不完整或缺少宏基因组数据。

    本研究已通过北京协和医院伦理审查委员会审批(审批号:ZS-1393),并豁免患者知情同意。

    根据CARS评分将ASD患儿分为轻—中度(CARS 30~35分)和重度(CARS≥36分),并由门诊医生评估患儿是否存在以下情况:(1) 胃肠道症状:便秘、腹痛、嗳气、腹泻和大便恶臭等,除外肠道感染、免疫异常、炎症性肠病、肠易激综合征、结肠疾病等;(2)挑食:仅吃某些种类食物,抗拒新种类食物;(3)兴奋:很难保持静止、集中注意力等;(4)过敏:过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、哮喘、特应性皮炎等病史;(5)情绪问题:易激惹、攻击行为、焦虑障碍等。

    通过静脉穿刺将空腹血样采集至含有促凝剂的试管中,样品采集后送至北京协和医院检验科进行检测。采用液相色谱串联质谱法检测血清T- 25(OH)D水平[14]。根据血清T- 25(OH)D水平将研究对象分为维生素D正常组[T-25(OH)D>30 μg/L]、不足组[20 μg/L≤T-25(OH)D ≤30 μg/L]和缺乏组[T-25(OH)D<20 μg/L][12-13]

    留取患儿新鲜粪便样本,立即置于干冰中保存,之后转运冻存于-80 ℃冰箱,集中进行粪便宏基因组测序。

    根据MO-BIO PowerSoil DNA提取试剂盒(Carlsbad,CA,U.S.)操作流程从粪便样本中提取DNA。在50 μL洗脱缓冲液中洗脱,采用凝胶电泳方法进行样本质检和质量级别的判定。所有DNA文库的构建均根据NEB Next Ultra DNA library prep kit (New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)试剂盒(根据DNA起始量大于100 ng的步骤进行)的实验操作流程进行。每个样本加上可识别标签,并将等量的标签文库用于测序。所有提取出来的样本DNA均置于-80 ℃冰箱保存以便进一步使用。

    运用Agilent 2100 High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)验证文库质量。采用ABI 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems,Waltham,MA,USA)对文库进行定量分析。应用Illumina Hiseq X Ten测序系统(Illumina,CA,U.S.)对制备好的文库进行双端PE×150 bp测序,并从原始数据中丢弃有测序接头污染的序列及低质量序列。采用的质量等级为Sanger/phred33/Illumina 1.8+。

    应用Trim galore(版本0.6.2)[15]去除接头和低质量reads(质量得分低于Q30)。质量控制后,采用Bowtie2(版本2.3.5.1)[16]与SAMtools(版本1.15.1)[17]和Bedtools(版本2.30.0)[18]识别和去除宿主人DNA序列(参考人hg38基因组)[19],并将非宿主序列用于下游分析。

    采用MetaPhlAn(Metagenomic Phylogenetic Analysis) 3.0[20]进行肠道微生物群落组成分析,参数stat_ q设置为0.1,其余使用默认参数。MetaPhlAn为一种计算工具,依赖于从约17 000个参考基因组(约13 500个细菌和古细菌、约3500个病毒和约110个真核基因组)中鉴定独特的进化枝特异性标记基因,该计算工具以物种级分辨率提供每个微生物进化枝的相对丰度。过滤后的读数被映射至所有参考基因组序列,以确定人类粪便样本中存在的不同分类群及各分类群的丰度。

    采用SPSS 26.0软件进行统计学分析,符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析;不符合正态分布的计量资料以中位数表示,组间比较采用Kruskal-Wallis H检验;计数资料以频数和百分数表示,组间比较采用卡方检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

    α多样性分析采用R软件的vegan包计算物种丰度(Richness)和香农指数(Shannon index)并绘制箱线图,通过Wilcoxon秩和检验比较组间差异,以P<0.05为差异具有统计学意义。β多样性分析采用Metaphlan 3.0软件储存库中的UniFrac.R(metaphlan/utils/calculate_ UniFrac.R) 计算加权UniFrac距离,再采用主坐标分析(principal coordinates analysis,PCoA)降维。采用vegan包中的adonis函数进行置换多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance,PERMANOVA)(置换999次)。R2越大说明该分组方案对差异的解释度越高,P<0.05说明本次检验的可信度高。对超过50%样本量且相对丰度>0.01%的分类群进行下游分析。线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)[21]用于识别细菌分类群中的生物标志物(LDA score阈值设定>2)。物种丰度与血清T- 25(OH)D水平的相关性分析采用Spearman相关性分析,fdr<0.1(Benjamini-Hochberg法)说明两检验变量具有相关性。

    2019年10月至2022年2月于北京协和医院风湿免疫科门诊就诊的1~12岁ASD患儿共148例,其中血清T- 25(OH)D检测和粪便样本采样时间间隔超过14 d的患儿85例,3个月内补充维生素D的患儿11例,病史资料不完整或缺少宏基因组数据的患儿6例,排除以上不符合纳入标准的病例,最终纳入ASD患儿共46例。按照血清T- 25(OH)D水平将其分为3组,维生素D正常组、不足组、缺乏组患儿分别为15例、16例、15例。血清T- 25(OH)D均值在维生素D正常组为(35.940±3.503)μg/L,维生素D不足组为(25.513±2.852)μg/L,维生素D缺乏组为(14.880± 4.056)g/L。轻-中度ASD患儿14例(30.4%),重度32例(69.6%)。3组患儿在性别、年龄、病情严重程度和共患病方面的详细资料见表 1

    表  1  ASD患儿一般临床资料
    组别 男性[n(%)] 年龄(x±s,岁) CARS评分(x±s) 重度ASD[n(%)]
    维生素D正常组(n=15) 12(80.0) 3.20±1.859 39.00±5.928 10(66.7)
    维生素D不足组(n=16) 11(68.8) 3.44±1.459 41.69±6.681 12(75.0)
    维生素D缺乏组(n=15) 11(73.3) 4.40±1.056 39.67±6.619 10(66.7)
    组别 胃肠道症状[n(%)] 挑食[n(%)] 兴奋[n(%)] 过敏[n(%)] 情绪问题[n(%)]
    维生素D正常组(n=15) 15(100) 12(80.0) 15(100) 14(93.3) 12(80.0)
    维生素D不足组(n=16) 15(93.8) 15(93.8) 16(100) 12(75.0) 14(87.5)
    维生素D缺乏组(n=15) 15(100) 13(86.7) 15(100) 12(80.0) 13(86.7)
    ASD: 孤独症谱系障碍;CARS:儿童孤独症评定量表
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    采用MetaPhlAn 3.0在46份粪便样本中鉴定出516种细菌,属于172个属、70个科、38个目、23个纲和11个门。在α多样性分析中,将维生素D正常组、不足组和缺乏组的物种丰度和香农指数进行两两比较,差异均无显著统计学意义(P>0.05,图 1)。在β多样性分析中,基于加权UniFrac距离的PCoA(图 2),并采用PERMANOVA进行统计检验,发现3组间物种组成亦无显著统计学差异(P>0.05),详见表 2

    图  1  孤独症谱系障碍患儿肠道菌群物种丰度和香农指数箱线图
    图  2  基于加权UniFrac距离的β多样性分析
    PCoA:主坐标分析
    表  2  孤独症谱系障碍患儿肠道菌群β多样性分析
    分组 置换多元方差分析
    R2 P
    维生素D缺乏组比正常组 0.0387 0.291
    维生素D不足组比正常组 0.0266 0.541
    维生素D不足组比缺乏组 0.0316 0.382
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    将低丰度分类群过滤后进行下游分析,经LEfSe分析,发现除门水平外,在纲、目、科、属、种水平共发现了差异性分类群19个,其中纲水平2个、目水平2个、科水平3个、属水平6个、种水平6个(图 3)。在种水平上,维生素D缺乏组沃氏嗜胆菌(Bilophila wadsworthia)、Asaccharobacter celatusAdlercreutzia equolifaciens、大肠埃希菌(Escherichia coli)丰度显著升高;而脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、Hungatella hathewayi丰度显著降低(图 4)。

    图  3  孤独症谱系障碍患儿肠道菌群差异分类进化树
    注:由内至外辐射的圆点代表了菌群由界至种的分类水平,不同水平上的每个圆点代表了该水平上的一个分类群,每个圆点的大小与该分类群的相对丰度成正比,红色圆点代表维生素D缺乏组中显著升高的分类群,绿色圆点代表维生素D正常组中显著升高的分类群,黄色圆点为无显著差异的分类群
    图  4  孤独症谱系障碍患儿肠道菌群物种水平的线性判别分析
    注:LDA Score阈值为2

    将包括门、纲、目、科、属、种在内的197个分类群与血清T- 25(OH)D水平进行Spearman相关性分析,发现脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilisr=0.42,fdr=0.073,P=0.004)与血清T- 25(OH)D水平呈正相关;而沃氏嗜胆菌(Bilophila wadsworthiar=-0.45,fdr=0.055,P=0.002)、Adlercreutzia equoli-faciens(r=-0.44,fdr=0.055,P=0.003)与血清T- 25(OH)D水平呈负相关(图 5)。

    图  5  血清总25-羟维生素D水平与物种相对丰度关系

    维生素D对免疫系统影响广泛,也与人体肠道菌群变化相关。继往研究发现,维生素D可从以下两个方面影响肠道微环境:一是影响肠道黏膜上皮细胞的通透性,二是影响免疫细胞的分化和功能,进而影响肠道菌群结构。首先,活性维生素D [1,25-(OH)2D3] 与VDR作用,通过claudin2和claudin12调节紧密连接蛋白ZO1、ZO2水平,有助于维持上皮屏障结构的完整性[22]。其次,1,25-(OH)2D3可刺激多种细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和上皮细胞)产生抗菌肽,还可增强巨噬细胞的吞噬反应。除此之外,1,25-(OH)2D3对适应性免疫具有调节作用,可促进Treg细胞分化,还可抑制Th1和Th17细胞因子的产生、抑制B细胞增殖和分化[22-24]。因此,维生素D具有维持肠道屏障功能和免疫调节的作用。部分维生素D来源于食物,经肠道吸收和羟化[25]。研究发现,肠道微生物通过成纤维细胞生长因子23调节维生素D代谢[26]。因此,维生素D与肠道菌群关系密切,二者相互影响。

    本研究为回顾性分析,并非所有患者在采集粪便样本时,同步采集血样本检测血清T- 25(OH)D。考虑肠道清洗期大约2周左右[27],故从148例就诊患儿中,排除了血、便采样时间间隔超过14 d的患儿85例。本研究聚焦于ASD患儿不同基线T- 25(OH)D水平下的菌群构成,故排除了血样本采集前3个月内补充维生素D的患儿。

    有研究表明,维生素D缺乏的ASD患儿症状更重,而补充维生素D可改善部分症状[28-29]。由于本研究纳入的患儿中,重度ASD占大多数(69.6%),且无补充维生素D相关病史,故未显现这一结果。在共患病评估方面,由于共患病在ASD患儿中较常见,尚无法从症状出现比例上发现差异。在未来研究中,建议采用量化共患病严重程度的问卷对患儿进行评估,如采用儿科胃肠道症状问卷评估ASD患儿的胃肠道症状等[30-31]

    α多样性和β多样性分析提示,维生素D正常组、不足组和缺乏组的ASD患儿肠道菌群组内物种多样性和组间物种构成均无显著差异。提示影响ASD患儿的肠道菌种丰度和组成结构改变的因素更为复杂,而维生素D可能影响某些菌种的组成。

    为寻找低维生素D水平的标记性物种,本研究仅对维生素D缺乏组与正常组进行LEfSe分析,结果发现,在维生素D缺乏组中,致病菌沃氏嗜胆菌的相对丰度显著升高,且其所属的进化分支嗜胆菌属(Bilophila)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)的相对丰度亦显著升高。δ-变形菌纲是一类硫酸盐还原菌,参与碳硫循环[32]。ASD患儿的肠道脱硫菌科丰度显著高于正常儿童[33-34]。有研究指出,ASD患儿的脱硫弧菌科丰度与粪便中的丙酸(propanoic acid,PPA)呈正相关[35]。进一步研究发现,脱硫弧菌能够产生PPA,PPA可通过血脑屏障,调节多巴胺等神经递质诱导ASD样行为[36]。此外,脱硫弧菌科还可产生有毒的硫化氢(hydrogen sulfide,H2S),H2S可减少肠黏液层的二硫键,从而破坏黏液屏障,导致上皮细胞暴露于细菌和毒素,可能导致肠道炎症[37]。更严重的是,沃氏嗜胆菌在无特定病原体的小鼠中可引起全身炎症[38],证实沃氏嗜胆菌等脱硫弧菌可促发炎症反应。

    此外,维生素D缺乏组中Adlercreutzia equolifaciensAsaccharobacter celatus显著升高。有研究指出,Adlercreutzia equolifaciens与ASD患儿较差的社会行为之间存在关联[39]Adlercreutzia equolifaciensAsaccharobacter celatus能够产生植物激素雌马酚,雌马酚可能干扰正常的小胶质细胞功能[39-40],提示其对神经系统存在潜在致病性。在体外实验中,雌马酚可诱导细胞内游离钙升高,进而使结肠癌细胞VDR表达增强[41]。但这两种细菌丰度升高是否引起肠道内雌马酚升高,进而增强维生素D的作用,或雌马酚通过“肠-脑轴”对中枢神经系统产生影响均尚未可知。维生素D缺乏组的大肠埃希菌亦显著升高,动物实验研究发现,维生素D缺乏易导致粘附侵袭性大肠杆菌诱导的肠上皮损伤[42],提示维生素D缺乏情况下,大肠埃希菌的潜在致病性。

    维生素D缺乏组中脆弱拟杆菌和Hungatella hathewayi显著降低。脆弱拟杆菌具有调节肠道炎症的作用[24],作为一种益生菌在ASD患儿中显著减少[43],给母体免疫激活后代口服脆弱拟杆菌,可改善其ASD相关的胃肠道症状和/或行为异常[44]。既往研究发现,补充维生素D与肠道脆弱拟杆数量增加相关[45],但其与维生素D是否具有协同抗炎作用,目前尚缺乏相关研究支持。Hungatella hathewayi为革兰氏染色阳性、专性厌氧菌[46],目前对其研究较少,益生或致病尚未可知[47-48]

    有趣的是,将所有水平菌群的相对丰度与血清T- 25(OH)D水平进行相关性分析发现,与血清T- 25(OH)D水平存在相关性的均为LEfSe分析中的标记性物种。沃氏嗜胆菌和Adlercreutzia equolifaciens与血清T- 25(OH)D水平呈负相关;而脆弱拟杆菌与血清T- 25(OH)D水平呈正相关。在既往研究中,不能产生1,25(OH)2D3的基因敲除小鼠肠道脱硫弧菌科的数量较多[49],补充维生素D可增加肠道脆弱拟杆数量[45],与本研究结果一致。因此,推测血清维生素D水平可能影响这些菌群在肠道内的定植。

    本研究发现维生素D缺乏的ASD患儿肠道沃氏嗜胆菌、Adlercreutzia equolifaciensAsaccharobacter celatus、大肠埃希菌丰度显著升高,而脆弱拟杆菌、Hungatella hathewayi丰度显著降低,提示ASD伴维生素D缺乏状态可能加重ASD患儿的肠道菌群紊乱。结合相关性分析结果,血清T-25(OH)D水平降低可使潜在的有害菌定植增加、益生菌定植减少,提示补充维生素D可能改善ASD患儿的肠道菌群紊乱,并治疗相关症状。但本研究样本量较小,未来可扩大样本量进一步验证,并深入挖掘维生素D对ASD患儿肠道菌群功能的潜在影响。

    志谢: 感谢美国疾病控制与预防中心的Amy Lambert博士提供非洲型寨卡病毒MR766毒株。
    作者贡献:李阿茜、孔令君负责实验设计,数据分析,论文撰写和修改;刘洋、李川参与实验设计,负责实验执行和实验结果整理;伊洁负责模拟临床样品评价部分的实验执行和数据分析;梁米芳、窦亚玲参与研究设计,并对论文进行审阅。
    利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突
  • 图  1   不同滴度ZKC2/2016毒株寨卡病毒样本的扩增曲线(A)和标准曲线(B)

    TCID50:同表 1

    表  1   病毒富集法对不同滴度寨卡病毒样本的检测结果

    毒株 病毒滴度(TCID50/mL) 检测阳性率[%, (n/N)]
    MR766 106 100(9/9)
    (非洲型) 105 100(9/9)
    104 100(9/9)
    103 100(9/9)
    102 100(9/9)
    101 100(9/9)
    100 66.7(6/9)
    10-1 11.1(1/9)
    ZKC2/2016 106 100(9/9)
    (亚洲型) 105 100(9/9)
    104 100(9/9)
    103 100(9/9)
    102 100(9/9)
    101 100(9/9)
    100 88.9(8/9)
    10-1 0(0/9)
    TCID50:半数组织培养感染剂量
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    表  2   病毒富集法检测寨卡病毒的抗干扰性评价结果

    干扰物质 干扰物质浓度 检测阳性率[%, (n/N)]
    胆红素 15 mg/L 100(3/3)
    血红蛋白 100 mg/L 100(3/3)
    甘油三酯 2000 mg/L 100(3/3)
    IgG 37.5 g/L 100(3/3)
    EDTA-Na2 2.5 g/L 100(3/3)
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    表  3   病毒富集法精密度评价结果

    毒株 病毒浓度 批次 批次内CV(%) 批次间CV(%)
    MR766 高浓度(106 TCID50/mL) 批次1 6.35 4.99
    (非洲型) 批次2 2.26
    批次3 4.13
    中浓度(104 TCID50/mL) 批次1 2.17 2.25
    批次2 2.63
    批次3 1.34
    低浓度(102 TCID50/mL) 批次1 1.94 2.15
    批次2 2.58
    批次3 1.83
    ZKC2/2016 高浓度(106 TCID50/mL) 批次1 6.31 8.31
    (亚洲型) 批次2 6.81
    批次3 7.40
    中浓度(104 TCID50/mL) 批次1 3.10 3.17
    批次2 2.99
    批次3 2.16
    低浓度(102 TCID50/mL) 批次1 3.58 3.35
    批次2 2.66
    批次3 1.06
    CV:变异系数;TCID50:同表 1
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    表  4   病毒富集法对模拟临床样本寨卡病毒的检测结果(n)

    检测结果 实际结果 总计
    阳性(+) 阴性(-)
    阳性(+) 73 0 73
    阴性(-) 0 271 271
    总计 73 271 344
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  • [1]

    Dick GW, Kitchen SF, Haddow AJ, et al. Isolations and serological specificity[J]. Trans R Soc Trop Med Hyg, 1952, 46: 509-520. DOI: 10.1016/0035-9203(52)90042-4

    [2]

    Duffy MR, Chen TH, Hancock WT, et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia[J]. N Engl J Med, 2009, 360: 2536-2543. DOI: 10.1056/NEJMoa0805715

    [3]

    Brasil P, Pereira JP Jr, Moreira ME, et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro[J]. N Engl J Med, 2016, 375: 2321-2534. DOI: 10.1056/NEJMoa1602412

    [4]

    Tang BL. Zika virus as a causative agent for primary microencephaly: the evidence so far[J]. Arch Microbiol, 2016, 198: 595-601. DOI: 10.1007/s00203-016-1268-7

    [5]

    Panchaud A, Stojanov M, Ammerdorffer A, et al. Emerging Role of Zika Virus in Adverse Fetal and Neonatal Outcomes[J]. Clin Microbiol Rev, 2016, 29: 659-694. DOI: 10.1128/CMR.00014-16

    [6]

    Klase ZA, Khakhina S, Schneider Ade B, et al. Zika Fetal Neuropathogenesis: Etiology of a Viral Syndrome[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2016, 10: e0004877. DOI: 10.1371/journal.pntd.0004877

    [7]

    Haddow AD, Schuh AJ, Yasuda CY, et al. Genetic characterization of Zika virus strains: geographic expansion of the Asian lineage[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2012, 6: e1477. DOI: 10.1371/journal.pntd.0001477

    [8]

    Landry ML, St George K. Laboratory Diagnosis of Zika Virus Infection[J]. Arch Pathol Lab Med, 2017, 141: 60-67. DOI: 10.5858/arpa.2016-0406-SA

    [9]

    Lanciotti RS, Kosoy OL, Laven JJ, et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007[J]. Emerg Infect Dis, 2008, 14: 1232-1239. DOI: 10.3201/eid1408.080287

    [10]

    Simpson DI. Zika Virus Infection in Man[J]. Trans R Soc Trop Med Hyg, 1964, 58: 335-338. DOI: 10.1016/0035-9203(64)90200-7

    [11]

    Medina FA, Torres G, Acevedo J, et al. Duration of the Presence of Infectious Zika Virus in Semen and Serum[J]. J Infect Dis, 2019, 219: 31-40.

    [12]

    Al-Soud WA, Jönsson LJ, Râdström P. Identification and characterization of immunoglobulin G in blood as a major inhibitor of diagnostic PCR[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38: 345-350. DOI: 10.1128/JCM.38.1.345-350.2000

    [13]

    Al-Soud WA, Rådström P. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells[J]. J Clin Microbiol, 2001, 39: 485-493. DOI: 10.1128/JCM.39.2.485-493.2001

    [14]

    Gourinat AC, O'connor O, Calvez E, et al. Detection of Zika virus in urine[J]. Emerg Infect Dis, 2015, 21: 84-86. DOI: 10.3201/eid2101.140894

    [15]

    Musso D, Roche C, Nhan TX, et al. Detection of Zika virus in saliva[J]. J Clin Virol, 2015, 68: 53-55. DOI: 10.1016/j.jcv.2015.04.021

  • 期刊类型引用(1)

    1. 任姣姣,张茜,高红,齐晶,白瑞北,李红娟,王朝晖. 维生素D调节肠道菌群改善孤独症谱系障碍儿童临床症状. 中国妇幼健康研究. 2025(01): 74-80 . 百度学术

    其他类型引用(1)

图(1)  /  表(4)
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-04-24
  • 录用日期:  2021-07-28
  • 刊出日期:  2022-05-29

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