女性阴道微生态系统由阴道内微生物菌群、内分泌系统、阴道局部解剖结构和免疫系统共同组成，其菌群结构复杂，多种微生物共生并发挥协同/拮抗效应。生理情况下，阴道菌群以乳杆菌为优势菌群^[1-2]，在体内外各种因素的影响下，阴道微生态失衡、致菌群异常变化，可继发阴道炎症或阴道感染^[3]，临床常见为细菌性阴道病(bacterial vaginosis, BV)、外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis, VVC)、需氧菌性阴道炎(aerobic vaginitis, AV)和滴虫性阴道炎(trichomonal vaginitis, TV)，由两种及以上致病微生物导致的阴道炎症属于混合性阴道炎^[4-6]。阴道微生态评价有助于单纯性阴道炎、混合性阴道炎的早期诊断，并进行针对性治疗，以促进阴道微生态恢复平衡^[3]。除阴道炎症外，妊娠^[7]、子宫恶性肿瘤术后放疗^[8]、宫颈病变或人乳头瘤病毒感染^[9-10]、多囊卵巢综合征^[11]等人群阴道微生态评价的报道近年来也明显增多。

阴道微生态评价方法主要包括形态学检测和功能性检测^[3]，近年来二代测序技术也逐渐应用于微生态评价^[4]，但受限于价格高昂、报告时间较长等原因，目前临床上仍以形态学检测为其主要参考指标。形态学检测易受技术人员主观因素的影响，且工作负荷较大，而自动化镜检结合人工智能分析系统(以下简称“自动化镜检”)有望克服上述困难。本研究旨在评估自动化镜检在阴道分泌物革兰氏染色涂片形态学分析中的临床应用价值。

1.   材料与方法

1.1   标本来源

回顾性收集2020年1—5月北京协和医院妇产科门诊患者的阴道分泌物标本(每例患者仅收集1份标本)，所有标本均为临床常规检验剩余样本，并剔除样本量过少的标本。

本研究已通过北京协和医院伦理审查委员会审批(审批号：S-T950)。

1.2   方法

1.2.1   涂片制备及革兰氏染色

将阴拭子置于试管中，滴加少量无菌生理盐水，沿试管壁反复用力挤压旋转以洗脱标本。滴加约0.5 mL生理盐水进行稀释(根据液体浊度调整)，调节至适当浓度后取1滴标本稀释液均匀涂片，理想浓度为25~30个细胞/高倍镜视野(high power field, HPF)，且细胞均匀分布。待涂片干燥、固定后进行革兰氏染色。革兰氏染色采用WST-R全自动革兰氏染色机(山东仕达思生物产业有限公司产品)。

1.2.2   显微镜检

每张涂片均进行自动化镜检和人工镜检，均为低倍镜检测20个视野、油镜检测45个视野。自动化镜检采用Comet-60au高倍镜检分析系统(山东仕达思生物产业有限公司产品)，并通过人工智能技术自动输出判定结果。人工镜检由2名具有丰富经验的研究人员分别独立判定，结果不一致时由第3人进行镜检复核。

1.3   结果判定标准

阴道微生态形态学判定标准参考Nugent评分^[12]和中华医学会妇产科学分会感染性疾病协作组制定的《阴道微生态评价的临床应用专家共识》^[3]。对菌群密集度、菌群多样性、乳杆菌样革兰氏阳性杆菌、阴道加德纳菌及拟杆菌样革兰氏阴性杆菌、革兰氏染色不定的弯曲杆菌、酵母样孢子、假菌丝和白细胞进行半定量分级描述，并量化评分(表 1)。BV的实验室诊断依据Nugent评分^[12]，计算乳杆菌样革兰氏阳性杆菌、阴道加德纳菌及拟杆菌样革兰氏阴性杆菌和革兰氏染色不定的弯曲杆菌评分之和，0~3分为正常，4~6分为中间型BV，≥7分为BV。阴道菌群密集度和菌群多样性评分均≤1者，判定为菌群抑制。以乳杆菌样革兰氏阳性杆菌为优势菌，且菌群密集度和菌群多样性评分均为3~4者，判定为菌群增殖过度^[3]。

表  1  阴道微生态形态学半定量评分标准

评分	菌群密集度[3]	菌群多样性[3]	乳杆菌样革兰氏阳性杆菌[12]	阴道加德纳菌及拟杆菌样革兰氏阴性杆菌[12]	革兰氏染色不定的弯曲杆菌[12]	酵母样孢子	假菌丝	白细胞(个/HPF)[3]
0	未见细菌及真菌	未见细菌及真菌	4+	阴性	阴性	阴性	阴性	≤10
1	Ⅰ级：1~9个/OIF	Ⅰ级：1~3种菌	3+	1+	1+或2+	阳性	阳性	＞10
2	Ⅱ级：10~99个/OIF	Ⅱ级：4~6种菌	2+	2+	3+或4+	-	-	-
3	Ⅲ级：≥100个/OIF	Ⅲ级：7~9种菌	1+	3+	-	-	-	-
4	Ⅳ级：细菌聚集成团或密集覆盖黏膜上皮细胞	Ⅳ级：≥10种菌	阴性	4+	-	-	-	-
OIF：油镜视野；HPF：高倍镜视野；1+：＜1个/OIF；2+：1~4个/OIF；3+：5~30个/OIF；4+：＞30个/OIF；-：无此项

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人工镜检判定结果：若2名研究人员的各项半定量评分差值的绝对值≤1，或定性结果判断一致时，取均值为最终结果；若2名研究人员的任何一项半定量评分差值的绝对值＞1，则由第3名研究人员进行独立镜检，半定量评分取3次结果中最接近的2个结果的均值为最终结果；若3次评分结果两两差值的绝对值相等，则取3个结果的均值为最终结果。定性结果判定中，以3次结果中2次一致结果为最终结果。

1.4   观察指标及定义

以人工镜检为对照，评估自动化镜检对各项结果检测的准确性：(1)完全一致率：自动化镜检与人工镜检半定量评分差值的绝对值≤0.5或定性结果判断一致的标本数量占标本总量的比率；(2)基本一致率：半定量评分差值的绝对值≤1.0的标本数量占标本总量的比率；(3)不一致率：半定量评分差值的绝对值≥1.5或定性结果判断不一致的标本数量占标本总量的比率。

1.5   样本量估算及偏倚控制

本研究按诊断性试验样本量的估算方法，以人工镜检为对照，如自动化镜检诊断的灵敏度为0.90±0.05，按95%置信区间水平，BV和VVC患者均为138例。本研究拟分别纳入临床初步诊断为BV和VVC患者各100例，并补充临床初步诊断为阴道炎但未明确为BV或VVC者及非阴道炎患者各100例，以减小选择偏倚。剔除达不到涂片细胞数要求的标本，以减小涂片质量对诊断准确性的影响。

1.6   统计学处理

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计算自动化镜检对各项目的完全一致率、基本一致率和不一致率。采用Kappa一致性检验评估自动化镜检与人工镜检对Nugent评分BV分类结果和真菌定性检测结果的一致性，结果以灵敏度、特异度、准确度表示。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   患者一般临床资料

共400例患者纳入本研究，其中来自妇科门诊293例(73.3%，293/400)，产科门诊89例(22.3%，89/400)，计划生育门诊18例(4.5%，18/400)；平均年龄为(32.6±9.3)岁。

2.2   人工镜检结果

经人工镜检Nugent评分判定为BV 124例(31.0%)、中间型BV 142例(35.5%)、正常134例(33.5%)。发现酵母样孢子或假菌丝阳性137例(34.3%)，其中BV合并真菌阳性29例(21.2%)、中间型BV合并真菌阳性68例(49.6%)，Nugent分类正常但真菌阳性40例(29.2%)。阴道菌群抑制者33例，其中32例(97.0%)为中间型BV，1例(3.0%)为Nugent分类正常；未见阴道菌群增殖过度患者。油镜镜下形态见图 1。

图  1  阴道分泌物革兰氏染色涂片显微镜下形态(油镜视野，×1000)

A.Nugent分类正常：菌群密集度Ⅱ级、菌群多样性Ⅰ级、乳杆菌样革兰氏阳性杆菌4+，Nugent评分为0；B.中间型BV：菌群密集度Ⅳ级、菌群多样性Ⅱ级、乳杆菌样革兰氏阳性杆菌3+、阴道加德纳菌或拟杆菌样革兰氏阴性杆菌4+、白细胞＞10个/高倍镜视野，Nugent评分为5；C. BV：菌群密集度Ⅳ级、菌群多样性Ⅰ级、阴道加德纳菌或拟杆菌样革兰氏阴性杆菌4+、白细胞＞10个/高倍镜视野，Nugent评分为8；D.真菌阳性：菌群密集度Ⅲ级、菌群多样性Ⅱ级、乳杆菌样革兰氏阳性杆菌4+、酵母样孢子(+)、假菌丝(+)、白细胞＞10个/高倍镜视野，Nugent评分为0；E. BV合并真菌阳性：菌群密集度Ⅳ级、菌群多样性Ⅲ级、乳杆菌样革兰氏阳性杆菌1+、阴道加德纳菌或拟杆菌样革兰氏阴性杆菌4+、酵母样孢子(+)、假菌丝(+)、白细胞＞10个高倍镜视野，Nugent评分为7；F.菌群抑制：镜下未见细菌及真菌，Nugent评分为4

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2.3   自动化镜检对阴道微生态形态学评价的准确性

在半定量分级项目方面，自动化镜检与人工镜检对阴道菌群多样性检测结果的完全一致率和基本一致率分别为52.3%和85.3%，对阴道菌群密集度、乳杆菌样革兰氏阳性杆菌、阴道加德纳菌及拟杆菌样革兰氏阴性杆菌和革兰氏染色不定的弯曲杆菌检测结果的完全一致率和基本一致率分别为81.8%~99.5%和93.3%~100%。在定性检测项目方面，自动化镜检与人工镜检对酵母样孢子和假菌丝检测结果的完全一致率均高于96%，对白细胞＞10个/HPF检测结果的完全一致率为70.5%，见表 2。

表  2  自动化镜检对阴道微生态形态学评价的准确性(%)

指标	菌群密集度	菌群多样性	乳杆菌样革兰氏阳性杆菌	阴道加德纳菌及拟杆菌样革兰氏阴性杆菌	革兰氏染色不定的弯曲杆菌	酵母样孢子	假菌丝	白细胞
完全一致率	81.8	52.3	83.0	82.8	99.5	96.8	97.3	70.5
基本一致率	97.8	85.3	94.0	93.3	100.0	NA	NA	NA
不一致率	1.3	5.5	4.5	6.0	0.0	3.3	2.8	29.5
NA：不适用

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2.4   自动化镜检Nugent评分判断的准确性

以人工镜检为金标准，根据Nugent评分，自动化镜检对BV分类诊断的灵敏度为87.1%，特异度为96.7%，准确度为90.8%，一致性检验Kappa值为0.861(P＜0.001)，见表 3。

表  3  自动化镜检对Nugent评分细菌性阴道病分类判定结果的交叉表

自动化镜检	人工镜检			合计
	BV	中间型BV	正常
BV	108	9	0	117
中间型BV	16	119	6	141
正常	0	6	136	142
合计	124	134	142	400

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2.5   自动化镜检对真菌定性检测结果的准确性

设定酵母样孢子或假菌丝中任一项检测阳性为真菌阳性。以人工镜检为金标准，自动化镜检对真菌定性检测的灵敏度为86.9%，特异度为98.5%，准确度为94.5%，一致性检验Kappa值为0.875(P＜0.001)，见表 4。

表  4  自动化镜检对真菌定性检测结果的交叉表

自动化镜检	人工镜检		合计
	阳性	阴性
阳性	119	4	123
阴性	18	259	277
合计	137	263	400

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3.   讨论

本研究为国内首次对阴道分泌物革兰氏染色涂片自动化镜检结合人工智能形态学分析结果与人工镜检结果进行比较，以评估自动化镜检在阴道微生态评价中的临床应用价值。结果显示，自动化镜检与人工镜检对阴道菌群多样性半定量分级检测结果的完全一致率和基本一致率分别为52.3%和85.3%，对阴道菌群密集度、乳杆菌样革兰氏阳性杆菌、阴道加德纳菌及拟杆菌样革兰氏阴性杆菌、革兰氏染色不定的弯曲杆菌半定量分级检测结果的完全一致率和基本一致率为81.8%~99.5%和93.3%~100%，对酵母样孢子和假菌丝定性检测结果的一致率均高于96%，对白细胞＞10个/HPF检测结果的完全一致率为70.5%。对Nugent评分BV分类、真菌定性检测的准确度分别为90.8%和94.5%，一致性检验Kappa值分别为0.861和0.875(P＜0.001)，提示Comet-60au高倍镜检分析系统对阴道分泌物革兰氏染色涂片中细菌与真菌形态学、BV分类及真菌定性检测结果与人工镜检结果的一致性均较高，对白细胞数目判定的一致性略低。

显微镜检查作为一项形态学检验项目，对检验人员的形态学经验要求较高，由于检查结果受检验人员主观因素影响较大，且工作负荷大，一直以来是临床检验技术的难点。近年来，人工智能与医学领域快速融合，在影像、病理、检验等学科的应用进行了探索。由于微生物形态学的复杂性，目前自动化镜检在临床微生物检验中仅初步应用于复杂程度相对较低的湿片镜检和抗酸染色镜检，其在复杂程度较高的革兰氏染色镜检中的应用尚处于探索性研究阶段。在显微镜图像自动化采集方面，虽然已有厂家开发了相关技术平台，但在革兰氏染色微生物形态学人工智能识别方面，鲜有可直接应用于临床的成熟技术。

Comet-60au高倍镜检分析系统是基于深度卷积神经网络搭建的目标检测模型结合机器视觉方法，旨在实现对阴道微生态显微图像中多种类型目标物的检测和分析。检测过程中将涂片插入装载模块后，显微镜可自动加载涂片并自动对焦、切换物镜、滴加镜油，自动采集图像、识别并输出结果以及计算Nugent评分，阅片结束后自动归位涂片、清洗物镜，检测速度不低于50张涂片/h。人工智能分析系统可识别的目标物包括杆菌、酵母样孢子、假菌丝、上皮细胞、白细胞等，每种目标物根据数量分为“多、少、无”3种情况，杆菌从形态上分为“长且卷曲”和“短且直立”两种类型，酵母样孢子从形态上分为“卵圆形孢子”和“芽生孢子”，假菌丝从形态和方向上标化为“水平”和“垂直”，上皮细胞和白细胞从染色程度上分为“深染”和“正常”两种情况。以上标化特征经排列组合可组成23 318种不同的显微图像场景，可见阴道微生态形态学评价具有高度复杂性。通过采集上述所有类型的样本图像，经微生物学专家对所需识别的病原体和细胞人工标注后建立训练集。依托百万级训练集，建立基于深度卷积神经网络搭建的目标检测模型，针对每一种图像识别类型设计优化的人工智能算法，最终实现阴道微生态形态学分析。

新的检验程序常规应用于临床前，实验室应对其性能进行验证。根据《临床微生物检验程序验证指南》，微生物显微镜检查评价方法与对照方法检测结果的符合率≥80%，即通过验证^[13]。本研究结果显示，自动化镜检与人工镜检对阴道菌群密集度、乳杆菌样革兰氏阳性杆菌、阴道加德纳菌及拟杆菌样革兰氏阴性杆菌检测结果的完全一致率和基本一致率分别为81.8%~83.0%和93.3%~97.8%；阴道菌群多样性作为复杂程度更高的形态学指标，自动化镜检与人工镜检对其检测结果的完全一致率虽偏低，但基本一致率可达85.3%，提示Comet-60au高倍镜检分析系统对阴道微生态形态学的评定性能可满足临床检测要求。在对Nugent评分BV分类的判断中，以人工镜检为对照，自动化镜检的准确度为90.8%，Kappa值为0.861(P＜0.001)，提示两种方法对BV分类判定的一致性亦较高。酵母样孢子和假菌丝阳性是诊断VVC的镜检指标，本研究自动化镜检与人工镜检对酵母样孢子和假菌丝定性检测结果的完全一致率分别为96.8%和97.3%，自动化镜检的准确度为94.5%，Kappa值为0.875(P＜0.001)，说明在对真菌定性检测中，Comet-60au高倍镜检分析系统与人工镜检亦具有较高的一致性。白细胞＞10个/HPF是Donders评分^[14]中进行AV诊断的评价指标之一。本研究自动化镜检与人工镜检对白细胞＞10个/HPF判定结果的完全一致率略低(70.5%)，可能原因：Donders评分所采用的检测方法为湿片镜检，本研究自动化镜检所采用的是革兰氏染色油镜镜检，然后将油镜视野下的判定结果换算为高倍镜视野下的结果，而人工镜检则直接采用高倍镜镜检。油镜镜检(×1000)与高倍镜镜检(×400)的镜下面积存在差异，加之标本中白细胞并非完全均匀分布于整个涂片，镜检视野的选择可能会影响两种方法对白细胞镜下数目判定结果的一致率。算法的进一步优化，将有助于提高这一指标的准确性。此外，Comet-60au系统已进行了阴道分泌物湿片人工智能自动化镜检功能的研发和验证，以满足Donders评分和滴虫镜检的方法学要求。

本研究局限性：(1)仅收集2例革兰氏染色不定的弯曲杆菌阳性标本，自动化镜检对该项目的检测性能需扩大样本量进一步验证。(2)采用Nugent评分作为BV的诊断标准，其获得了2015年美国疾病控制与预防中心制定的《2015年性传播疾病治疗指南》^[15]、2020年美国妇产科学会制定的第215号实践指南《非妊娠患者阴道炎》^[16]和中华医学会妇产科学分会感染性疾病协作组制定的《细菌性阴道病诊治指南(2021修订版)》^[17]共同推荐。但自动化镜检未对其他BV形态学诊断标准(如Hay-Ison标准^[18])的检测准确性进行验证。(3)仅对阴道分泌物涂片进行革兰氏染色，对细菌、真菌和白细胞等进行形态学分析，但对于革兰氏染色难以观察到的滴虫、支原体、衣原体、病毒等阴道炎病原体，以及使用其他镜检方法进行判定的诊断标准，未能进行自动化镜检准确性验证。对于AV的诊断，《2018欧洲国际性病控制联盟/世界卫生组织关于阴道分泌物(阴道炎症)管理指南》^[19]和中华医学会妇产科学分会感染性疾病协作组制定的《需氧菌性阴道炎诊治专家共识(2021版)》^[20]均采用Donders评分^[14]，其需对阴道分泌物进行湿片镜检，因而本文未对该系统诊断AV的准确性进行评定；对于VVC的诊断，美国指南^[15-16]、欧洲指南^[19]和我国中华医学会妇产科学分会感染性疾病协作组2012年《外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)诊治规范修订稿》^[21]均推荐进行真菌镜检，其中阴道分泌物湿片镜检的灵敏度为40%~60%，革兰氏染色镜检的灵敏度约为65%^[19]，本研究仅采用了革兰氏染色，未对湿片镜检法进行验证。

综上，在对阴道分泌物革兰氏染色涂片阴道微生态形态学评价中，自动化镜检与人工镜检具有较好的一致性，可通过Nugent评分、酵母样孢子和假菌丝镜检结果提供BV和VVC的诊断依据，显著提高实验室镜检效率、降低人工镜检劳动负荷，具有较好的临床应用价值。