糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病最常见的慢性并发症之一，患病率约50%^[1-4]。目前DPN的诊断大多依赖于临床症状体征以及电生理检查等^[4-5]，而这些传统检查方法多用于诊断大神经纤维病变。近年研究发现，在DPN发病过程中，小神经纤维最早出现损伤^[6-7]，故小神经纤维的检查技术可用于DPN的早期诊断。通过皮肤活检量化表皮内神经纤维密度(intraepidermal nerve fiber density, IENFD)是当前评估小神经纤维损伤的金标准，但IENFD是一种侵入性检查，具有临床应用性差以及可重复性不强的局限性^{[3-4, 8]}，故亟需一种快速、可重复、定量测量小神经纤维的无创技术。角膜共聚焦显微镜(corneal confocal microscopy, CCM)正是这样一种技术^[3], 在DPN诊断中具有良好的应用前景。本文就CCM评估糖尿病神经病变的临床应用研究以及CCM相关人工智能分析方法进行阐述。

1.   CCM与角膜神经

角膜是人体神经支配最密集的部分，每平方毫米约有7000个痛觉感受器，是皮肤敏感度的300~600倍^{[2, 9]}。绝大多数角膜神经纤维为感觉纤维，起源于三叉神经眼支^[9-10]，自角巩膜缘呈放射状分布，经睫状神经节后纤维进入角膜，随后大部分神经束穿过Bowman层，在Bowman层和角膜上皮基底膜之间形成密集的角膜基底下神经丛^{[1, 8, 11]}。借助角膜的透明性这一优势，CCM可直接可视化和量化角膜神经纤维，并通过二维扫描、多个图像实时映射或者三维图像清晰地显示角膜基底下神经丛。

可用于评估角膜神经病变的参数包括角膜神经纤维密度(corneal nerve fiber density, CNFD)，即每平方毫米神经纤维主干的数量；角膜神经分支密度(corneal nerve branch density, CNBD)，即每平方毫米从神经纤维主干分出的分支数量；角膜神经纤维长度(corneal nerve fiber length, CNFL)，即所有神经纤维包括分支的总长度和神经纤维扭曲度或扭转系数(tortuosity coefficient, TC)。

CCM能够重复检测上述参数的变化^[12-13]。而目前已有研究证实由糖尿病引起的周围神经病变与CCM检测到的角膜基底下神经丛的改变密切相关^{[1-2, 11]}。

2.   CCM在评价DPN中的作用

2.1   早期诊断DPN

2.1.1   诊断价值

有研究指出角膜神经纤维的改变是DPN的早期迹象，CCM可比电生理学和振动感觉检测更早发现周围神经纤维异常^[13]。Chen等^[5]对61例1型糖尿病(diabetes mellitus type 1，T1DM)患者和26名匹配的健康受试者(对照)进行了CCM和皮肤活检量化IENFD评估神经病变，结果显示CCM与IENFD的诊断效率相当(用于识别DPN的AUC值：CNFL为0.82，CNFD为0.80，IENFD为0.66，P=0.14)。Ziegler等^[6]通过CCM、皮肤活检量化IENFD和神经生理学测试确定86例新发2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者和48名匹配的健康受试者的早期神经损伤，同样认为CCM和IENFD均可早期识别小纤维损伤，CCM可作为早期检测神经病变的无创检查工具。

Asghar等^[14]对37例糖耐量受损患者和20名年龄匹配的健康受试者进行了神经传导功能检查、定量感觉测试、皮肤活检量化IENFD和CCM等对神经病变进行全面评估，结果在糖耐量受损患者中用IENFD和CCM均检测到了神经病变的证据，由此推断CCM可预测DPN的发生。Szalai等^[15]采用CCM发现了无临床神经病变的T1DM患者的角膜神经纤维缺失，Yan等^[16]在无临床神经病变表现的T2DM患者中观察到了角膜神经纤维病变。以上研究均支持CCM在DPN的二级预防中发挥着重要作用。

2.1.2   影响DPN诊断价值的角膜神经参数

Jiang等^[17]基于大样本量荟萃分析显示，与对照组和无DPN的糖尿病患者相比，DPN患者的CNFD、CNBD和CNFL显著降低，而TC变化并不显著，认为TC对于识别DPN仍存在争议。Tavakoli等^[7]对101例糖尿病患者和17名健康受试者进行了CCM检查，发现CNFD、CNFL、CNBD随着神经病变严重程度的增加而显著降低，并指出CNFL可作为诊断DPN的最佳参数。本研究中心对98例T2DM患者和30名年龄匹配的健康受试者进行神经传导速度及CCM检查，以神经传导速度异常作为诊断DPN的金标准，绘制角膜神经参数CNFL、CNFD、CNBD的受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线，发现CNFL为诊断DPN的最佳参数(灵敏度：82.4%，特异度：85.7%)^[18]。绝大多数研究已证实CNFL是评估DPN最可靠的参数，并认为角膜神经参数在左、右眼之间无显著性差异，且与糖尿病的类型无显著相关性，但目前采用角膜参数评估DPN仍存在局限性，例如由于CNFL和CNFD值会随着年龄的增长而减少^{[1, 8]}，因此建议制订年龄标准化的角膜参数参考值范围。

2.2   评估DPN严重程度

Malik等^[10]收集了18例患有不同级别神经病变的糖尿病患者和18名年龄匹配的健康受试者的Bowman层图像，与健康受试者相比，糖尿病患者的CNFD、CNFL和CNBD值均降低，且随着神经病变严重程度的增加，上述参数值逐渐降低，这一发现具有里程碑意义。Ferdousi等^[19]对143例T1DM和T2DM患者(其中无神经病变51例、轻度神经病变47例、中重度神经病变45例)以及年龄匹配的30名健康受试者进行了定量感觉测试、神经传导研究和CCM，结果显示与对照组相比，T1DM和T2DM患者的CNFD、CNFL和CNBD值均降低，且随着神经病变的加重，CNFD(个/mm²)(26.61±1.05比24.47±1.09比22.4±1.14, P<0.0001)、CNFL(mm/mm²)(23.31± 0.96比20.84±1.004比19.27±1.04, P=0.002)和CNBD(个/mm²)(64.07± 4.39比58.49±4.76比45.60±4.5, P<0.0001)进一步降低。上述研究均提示可通过CCM检查评估DPN严重程度。

2.3   监测、评估疗效

角膜神经丛也被用作判断糖尿病干预疗效的形态学指标之一。研究显示，糖尿病患者采取措施改善血糖控制，特别是糖化血红蛋白改善后，角膜神经可再生，在接受胰腺移植的T1DM患者中，术后6个月CNFD、CNBD和CNFL均有所改善，提示角膜神经丛可作为手术干预后的次要预后指标^[2]。此外，在一项对25例轻至中度神经病变糖尿病患者的前瞻性研究中，角膜神经形态随血糖控制的改善而有所改善^[20]。CCM的优势在于可通过重复检查评估干预措施是否有效，未来研究需确定CCM参数的改善是否预示着传统神经病变预后指标如神经传导速度的改善，以及患者临床预后(如疼痛、截肢和生活质量)的改善。

3.   CCM在评价糖尿病自主神经病变中的作用

糖尿病自主神经病变(diabetic autonomic neuropathy, DAN)的早期诊断较困难，而心血管自主神经病变(cardiovascular autonomic neuropathy, CAN)是临床上DAN最重要的类型。目前通常采用心血管反射试验评估DAN，但这种方法因受伴发的心血管疾病以及血管活性药物的影响，灵敏度和特异度有限^[21-22]。Tavakoli等^[22]对19例伴DAN的糖尿病患者和15例不伴DAN的糖尿病患者以及18名健康受试者进行了CCM评估，证明CCM对DAN具有良好的诊断价值。Maddaloni等^[23]对36例T1DM患者和20名健康受试者进行了自主神经病变评估以及CCM检测，结果发现T1DM患者与健康受试者相比，CNFD、CNBD、CNFL均降低，而CAN患者的CNFD显著降低。早期诊断和干预对于预防DAN进展至关重要，而CCM或许有望成为DAN早期无创诊断的选择。

4.   CCM在评价糖尿病微血管并发症中的作用

部分研究证实糖尿病患者角膜神经病变早于视网膜病变和肾脏病变，Petropoulos等^[24]对53例T1DM患者[37例伴有糖尿病视网膜病变(diabetes retinopathy, DR)，16例不伴有DR]和27例健康受试者进行了CCM、微量蛋白尿等评估，结果显示与对照组相比，不伴有DR的患者CNFD、CNBD、CNFL显著降低，且伴有DR的患者比不伴有DR的患者CNFD、CNBD、CNFL进一步降低；不伴有微量蛋白尿患者的CNFD、CNBD和CNFL显著降低，伴有微量蛋白尿患者的CNFD、CNBD和CNFL进一步降低。Srinivasan等^[25]确定了CNFL的降低是T1DM患者DR恶化的预测因素之一。上述研究提示CCM可能是干预和预防微血管并发症进展的最早机会窗口，由于糖尿病微血管并发症患病率较高，未来需进行更大规模的前瞻性研究以确定CCM用于预测糖尿病微血管并发症的价值。

5.   人工智能在CCM神经纤维图像分析中的应用

临床研究表明，DPN与角膜神经纤维丢失有关。通过CCM图像能够对DPN进行定量评估，并有潜力成为理想的替代指标。其在识别糖尿病患者发生DPN风险方面具有预测能力，并已被用于显示神经纤维修复的几项临床干预研究^[26]。DPN与神经纤维医学指标的相关研究均表明，CCM检查能够实时、可对比地观测角膜神经纤维形态和分布的变化，在DPN患者的前期检测、中期发展、疗效判断等多种时期的诊断过程中发挥关键作用。

交互式人工分析被用于从这些CCM图像中获得测量值，如CNFD、CNFL、CNBD等^[27]。但这种人工分析手段通常存在耗时长、工作量大、易受主观因素影响、定量结果的重现性差(尤其是CNBD)等问题，给实际临床应用带来了相当大的困难，尤其在进行纵向随访研究时^[7]。因此，迫切需要一种自动化的检测方式以获得CCM图像的神经纤维参数，为医生提供有效的辅助诊断工具。角膜神经纤维参数自动提取算法是检测DPN的一种客观、可复现的手段。

基于CCM图像的DPN辅助诊断研究对糖尿病的诊断与治疗意义重大，早预防、早发现、早治疗是目前糖尿病患者最好的治疗方法。然而目前在CCM图像神经纤维自动化检测方面的研究相对较少。整体而言，CCM图像神经纤维自动化检测分为两个阶段：(1)CCM图像神经纤维自动分割，把CCM图像以像素为单位标记为神经纤维和图像背景；(2)CCM图像神经纤维参数(CNBD、CNFD、CNFL等)的自动计算。

Dabbah等^[28]提出了一种多尺度“双模型滤波器”(dual-model filter，DMF)，可将基于偶对称实值Gabor小波变换的前景提取模型与根据噪声级别对输出进行缩放的低通高斯背景提取模型相结合，对CCM图像中的神经纤维进行提取；使用最小均方误差算法，计算以特定图像像素为中心块的局部神经纤维方向，全局应用低通高斯滤波器进行图像背景的提取。Chen等^[29]在此研究基础上进行优化，采用基于金字塔结构的像素级特征向量，利用随机森林分类器、形态学优化方法等估计神经纤维在每个像素位置的方向，最终得到神经纤维的分割结果图。

Kim等^[30]基于神经纤维形态提出一种分割方法，但这种方法存在对比度低和聚焦不精准的问题。随着人工智能和深度学习的发展，深度学习模型也被运用到这一领域中。陈新建等^[31]应用改进后的U-Net进行CCM图像神经纤维分割，融入多尺度分离与融合模块增大感受野，获得了较为有效的CCM图像神经纤维分割结果。为了提升深度学习模型的准确性，Williams等^[32]独立训练了5个深度学习CCM图像神经纤维分割模型，并采取对同一位置分割结构多模型结合投票的机制，有效提升了深度学习模型分割结果的准确性。

Yildiz等^[33]提出了一种新的基于生成性对抗网络(generative adricative network，GAN)的深度学习算法，以实现对于CCM神经图像的分割。该研究收集了85名受试者的活体角膜共焦显微镜(in vivo corneal confocal microscopy, IVCM)图像，由3名临床医生完成数据标注，分别对基于U-Net和GAN的2种图像分割方法进行训练和测试。结果显示，基于GAN的算法与U-Net具有相似的相关性和Bland-Altman分析结果，但精确度比U-Net更高。

Salahuddin等^[34]针对CCM图像中像素分布不均衡造成的自动分割中神经显微结果灵敏度低的问题，在图像上评估深度学习网络U-Net中3个不同参数的损失函数，并对结果进行了讨论。分析观察到，Tversky损失函数的最佳训练时间和收敛时间比二进制交叉熵(binary cross entropy)和Dice损失函数好。这有助于更快获得更好的结果，意味着诊断效率的提高。

Kucharski等^[35]提出了一种基于分水岭算法的角膜内皮细胞标记驱动分割方法和基于滑动窗口训练的编码-解码卷积神经网络，用于预测细胞中心(标记)和细胞边界的概率。该研究利用预测标记对神经网络输出的边缘概率图进行分水岭分割，重点研究了3种卷积神经网络模型(U-Net、SegNet和W-Net)的分割性能，结果显示该方法的细胞检测准确度为97.72%。

Mou等^[36]提出了一种新的曲线结构分割网络(CS-Net)，其在编码和解码器中引入了一种自注意机制以学习曲线结构丰富的层次表示。该研究利用空间注意力和通道注意力两类注意力模块，增强类间辨别和类内响应能力，进一步自适应地将局部特征与其全局依赖性和规范化相结合，并将二维注意力机制扩展至三维，以增强网络在不同层之间聚集深度信息的能力。实验结果表明，该方法在多种度量指标上均优于其他最新算法。

Wei等^[37]采用基于深度学习算法的卷积神经网络建立了角膜基底下神经分割网络。该研究对CNS网络进行了552次训练，并在北京大学第三医院收集的139份IVCM图像上进行了测试，图像由3名资深眼科医生标记，然后形成分割标准答案。该模型的AUC为0.96(95% CI：0.935~0.983)，精度为94%，最小dice系数损失为0.12。分割任务的灵敏度为96%，特异度为75%，CNFL评估任务的相对偏差率为16%。

现有的CCM图像神经纤维自动检测方法虽可对部分神经纤维做到基本有效的分割，但仍然存在神经纤维分割结果连贯性差、部分小神经纤维/低对比度神经纤维分支无法正确检测的问题，从而影响神经纤维参数的计算结果。基于深度学习的CCM神经纤维自动分割方法的结果优于传统图像处理和机器学习方法，但目前基于深度学习的CCM神经纤维自动分割方法研究相对较少，如何针对CCM图像的自身特点进行深度学习模型的优化仍然需要进一步研究。

6.   小结

CCM可作为早期神经病变的可重复、无创检查手段。通过CCM检查不仅可评估DPN的严重程度，还可实现DPN早期预测和诊断，从而提早干预，延缓DPN的进展，提高糖尿病患者的生活质量。但采用角膜神经参数评估DPN目前仍存在局限性，基于人工智能的角膜神经纤维医学指标提取算法是检测DPN的一种客观、可复现的手段，但现有的CCM图像神经纤维自动检测方法仍然有较大提升空间，未来应充分挖掘CCM图像的自身特点以及基于深度学习的CCM神经纤维自动分割方法，以进一步拓展CCM在糖尿病神经病变中的临床应用。