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成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识(2023)
详细信息Expert Consensus on Nucleic Acid of Amplification Techniques Test for the Diagnosis of Pathogens in Adult Respiratory Tract Infections(2023)
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摘要: 呼吸道感染性疾病在临床中极为常见，病原体的快速检测和精准诊断是其有效治疗的前提。传统微生物学及免疫学技术对呼吸道病原体检测的灵敏度偏低，核酸检测技术的发展和临床应用大幅提高了呼吸道病原体的诊断能力。如何基于患者基础疾病、呼吸道感染类型及病原谱合理选择核酸检测技术并正确理解其临床应用价值，成为重要的临床问题。为此，中华检验医学培训工程专家委员会联合中华医学会呼吸病学分会组织我国多学科专家共同撰写了《成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识(2023)》。该共识参考国内外指南及文献，分析了实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术、等温扩增技术、数字PCR技术、核酸即时检测技术和病原体高通量测序技术的临床应用场景、技术特点和性能验证要求，以及该类技术在成人急性上呼吸道感染、气管支气管炎、社区获得性肺炎、医院获得性肺炎/呼吸机相关性肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、肺结核和免疫功能受损人群呼吸道感染中的应用，以供临床参考借鉴。Abstract: Respiratory tract infection is one of the most prevalent medical conditions. Rapid and accurate diagnosis of pathogens is crucial for precise and effective treatment. However, the sensitivity of traditional microbiological and immunological techniques for respiratory pathogens detection is low.The development and clinical applications of nucleic acid testing technology have dramatically improved the ability to diagnose respiratory pathogens. The rational usage of appropriate nucleic acid testing techniques, based on the underlying diseases, the type of respiratory tract infections, and pathogen spectrum, as well as the correct understanding of its diagnostic sig- nificance, has become an important clinical challenge. Therefore, the Committee of Chinese Laboratory Medical Education and Chinese Thoracic Society initiated a multi-disciplinary Chinese expert consensus. Based on both the domestic and international guidelines and literature, the expert consensus analyzes the clinical application scenarios, technical characteristics, and performance validation requirements pertaining to real-time fluorescence polymerase chain reaction (PCR), isothermal amplification technology, digital PCR, nucleic acid point-of-care testing, and metagenomics next generation sequencing. Furthermore, it also examines the wide-ranging applications of these techniques in diagnosing and managing respiratory tract infections, including acute upper respiratory tract infections, tracheobronchitis, community-acquired pneumonia, hospital-acquired pneumonia/ventilator-associated pneumonia, acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease, tuberculosis, and respiratory infections in immunocompromised adults. We hope the consensus will provide helpful reference for clinicians.
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Keywords:
- respiratory infection /
- adults /
- pathogenic diagnosis /
- nucleic acid test /
- expert consensus
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系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种多系统、多脏器受累的慢性自身免疫性疾病，抗自身细胞核成分的抗核抗体大量生成并激活补体系统，导致多系统靶器官损伤是其主要疾病特征[1]；该病多见于20~40岁育龄女性，但儿童亦可患病，且SLE患儿更易出现多系统损伤[2]。SLE发病原因可能涉及淋巴细胞过度激活、自身抗体产生等多方面因素[3]，但确切机制尚未完全阐明。
蛋白的糖基化修饰是自然界普遍存在的生物学现象，为蛋白质翻译过程中或翻译后的一种重要加工过程。其在蛋白质的生物学功能表达调控中发挥重要作用，如大部分免疫细胞膜表面的免疫相关受体(Toll样受体、T淋巴细胞受体、B淋巴细胞受体等)均由糖蛋白构成，糖蛋白几乎涉及了机体免疫网络的全部环节[3]，故对于免疫系统而言，蛋白的正确糖基化意义重大。作为自身免疫性疾病，SLE发病可能与蛋白质糖基化修饰异常导致新抗原表位产生，进而激活免疫细胞、破坏免疫耐受平衡相关[4-6]，且有研究发现IgG糖基化改变与SLE疾病活动度相关，并可能为SLE的诱发因素[7-8]，但目前临床对糖基化与SLE的相关性仍缺乏全面认识。
异常糖基化与聚糖的变化密不可分，后者为一类分子结构复杂且数量庞大的多糖，由多种结构相同或不同的单糖通过糖苷键结合而成，由于其结构复杂，直接分析聚糖变化在SLE发病中的作用难度较大。研究显示，聚糖降解后以单糖的形式存在，血清降解单糖水平一定程度上可反映聚糖数量和结构变化[9]，且已证实血清降解单糖水平在2型糖尿病、心血管疾病、过敏性紫癜等多种疾病中呈独特性改变[10-12]，但目前SLE患儿血清降解单糖变化特征及其临床意义的相关研究较匮乏。本研究以健康儿童为对照，探究SLE患儿血清甘露糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖5种降解单糖水平变化，并分析其与SLE疾病活动度、淋巴细胞亚群、免疫球蛋白等指标的相关性，以期为SLE病因学研究和病情评估提供新的思路。
1. 资料与方法
1.1 研究对象及分组
本研究为回顾性病例对照研究。研究对象为2019年1月—2022年3月青岛大学附属医院儿童肾脏风湿免疫科首次确诊并住院治疗的SLE患儿(SLE组)及同期于该院体检且年龄、性别与SLE患儿按1∶1比例相匹配的健康儿童(对照组)。SLE组纳入标准：(1)诊断符合2012年国际系统性红斑狼疮研究临床协作组(Systemic Lupus International Collaborat-ing Clinics, SLICC) 制定的SLE分类标准[13]，且血清标本采集前4周内未行激素、免疫抑制剂治疗；(2)年龄≤18岁；(3)研究相关临床资料无明显缺失。排除标准：(1)合并其他自身免疫系统疾病，如混合结缔组织病、类风湿关节炎、药物性狼疮、干燥综合征等；(2)合并糖尿病、全身感染以及严重肝肾功能不全者。
对照组纳入标准：体检证实无研究相关疾病，如肿瘤、糖尿病、感染性疾病、肝肾功能不全等。排除标准：研究相关临床资料明显缺失。
本研究已通过青岛大学附属医院伦理审查委员会批准(审批号：QYFYWZLL26173)，并豁免患儿及其监护人知情同意。
1.2 方法
1.2.1 基线资料收集
收集SLE组患儿CD3+ T淋巴细胞计数、CD4+T淋巴细胞计数、CD4+T/CD8+ T淋巴细胞比值、自然杀伤(natural killer, NK)细胞计数、B淋巴细胞计数等外周血淋巴细胞亚群指标，IgA、IgE、IgG、IgM等免疫球蛋白指标，以及补体C3、C4水平。采用系统性红斑狼疮疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index, SLEDAI)评估疾病活动度，SLEDAI评分≤6分、7~12分、＞12分分别为轻度疾病活动、中度疾病活动和重度疾病活动[13]。
1.2.2 血清标本采集
采集SLE患儿及健康儿童清晨空腹(餐后6 h)外周静脉血4 mL置于无菌抗凝管中，离心后取上清液200 μL，置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。
1.2.3 血清降解单糖水平检测
采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)技术检测两组血清5种降解单糖水平，仪器为高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，检测方法如下：取一个洁净的EP管，依次加入盐酸溶液(6 mol/L)10 μL、鼠李糖(1 g/L)5 μL及血清5 μL，混匀后将EP管置于聚合酶链式反应仪中，运行酸解程序(100 ℃ 10 min，4 ℃ 5 min)；向EP管中加入氢氧化钠溶液(3 mol/L)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(0.5 mol/L)各20 μL，运行衍生程序(70 ℃ 40 min，4 ℃ 10 min)；向EP管中加入乙酸铵缓冲溶液20 μL、氯仿100 μL，萃取后离心(离心半径30 cm，13 300 r/min离心15 min)，取50 μL上清液进行HPLC分析(参数见表 1)。将标准单糖混合溶液等梯度浓度稀释为10个梯度，通过HPLC分析可获得单糖标准品HPLC色谱图(图 1A)。以单糖标准品浓度为横坐标，对应的HPLC峰面积为纵坐标，绘制单糖标准曲线，并计算单糖标准曲线方程式。将血清标本降解单糖HPLC色谱图(图 1B)的峰面积代入标准曲线方程式，即可获得血清降解单糖浓度。
表 1 高效液相色谱仪分析的各项参数指标 参数 柱温 37 ℃ 流动相 乙腈、乙酸铵缓冲溶液(pH=5.5) 流速 1 mL/min 进样体积 20 μL 时间梯度 0 min→10 min→15 min→20 min 乙腈浓度梯度 15%→22%→24%→15% 乙酸铵浓度梯度 85%→78%→76%→85% 检测波长 254 nm 参比波长 350 nm 1.3 样本量估算
因既往无类似研究，根据预实验结果设定SLE患儿半乳糖升高的概率为0.9，健康对照儿童为0.15，两组样本比例为1∶1，在检验水准α为0.05、把握度(1-β)为90%的情况下，经估算SLE患儿、健康对照儿童最低所需样本均为40例。
1.4 统计学处理
采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。血清降解单糖水平及SLEDAI评分为正态分布计量资料，以均数±标准差表示，SLE组与对照组组间比较采用t检验；SLE组不同疾病活动度患者的比较采用单因素方差分析(组间两两比较采用Bonferroni检验)。采用Pearson线性相关法分析血清降解单糖水平与SLE患儿SLEDAI评分及免疫指标的相关性。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般临床资料
共入选符合纳入与排除标准的SLE患儿45例，健康对照儿童50名。SLE组男童7例，女童38例；年龄(14.35±2.45)岁；轻度疾病活动13例、中度疾病活动15例、重度疾病活动17例。对照组男童8名，女童42名；年龄(13.75±2.17)岁。SLE组与对照组以及不同疾病活动度SLE患儿间性别、年龄差异均无统计学意义(P均＞0.05)。
SLE组患儿中，SLEDAI评分为(15.11±3.68)分，CD3+ T淋巴细胞计数为(0.64±0.36)×109/L，CD4+ T淋巴细胞计数为(0.24±0.21)×109/L，CD4+T/CD8+T淋巴细胞比值为0.62±0.22，NK细胞计数为(0.32±0.13)×109/L，B淋巴细胞计数为(0.61±0.44)×109/L，IgA为(3.13±0.38)g/L，IgE为(355.8±40.0)U/L，IgG为(15.68±5.39)g/L，IgM为(1.48±0.85)g/L，C3为(0.74±0.46)g/L，C4为(0.13±0.11)g/L。
2.2 SLE患儿血清降解单糖水平变化
SLE组血清甘露糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖水平均高于对照组(P均＜0.05)，见图 2。
2.3 不同疾病活动度SLE患儿血清降解单糖水平变化
重度疾病活动SLE患儿血清甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖水平高于中度疾病活动患儿(P均＜0.05)，且中度疾病活动患儿上述三种降解单糖水平高于轻度疾病活动患儿(P均＜0.05)，不同疾病活动度SLE患儿的氨基葡萄糖、氨基半乳糖水平均无显著差异(P均＞0.05)，见图 3。
2.4 SLE患儿血清降解单糖水平与疾病活动度及免疫学指标的相关性
Pearson相关性分析显示，SLE组患儿血清甘露糖、氨基葡萄糖水平与SLEDAI评分、B淋巴细胞计数、IgG水平等均呈正相关；氨基半乳糖与B淋巴细胞计数、IgA水平均呈正相关；N-乙酰氨基葡萄糖与SLEDAI评分呈正相关；半乳糖与SLEDAI评分、B淋巴细胞计数、IgG水平、补体C4水平均呈正相关，见表 2。
表 2 SLE患儿血清降解单糖水平与疾病活动度及免疫学指标相关性分析结果(r)指标 甘露糖 氨基葡萄糖 氨基半乳糖 N-乙酰氨基葡萄糖 半乳糖 SLEDAI评分 0.844** 0.744** 0.269 0.641** 0.649** CD3+T淋巴细胞计数 0.419 0.421 -0.318 0.222 0.366 CD4+T淋巴细胞计数 0.299 0.325 0.293 0.068 0.308 CD4+T/CD8+T淋巴细胞比值 0.544 0.495 0.406 0.349 0.315 自然杀伤细胞计数 0.597 0.351 0.377 0.560 0.628 B淋巴细胞计数 0.549** 0.682** 0.438* 0.227 0.466** IgA 0.006 0.018 0.818** -0.127 -0.006 IgE 0.430 0.406 -0.370 0.091 0.442 IgG 0.839** 0.821** 0.030 0.571 0.729* IgM -0.139 -0.212 0.345 -0.139 -0.273 C3 0.419 0.382 -0.530 0.333 0.312 C4 0.696** 0.493 -0.402 0.237 0.658** SLE：同图 2；SLEDAI：系统性红斑狼疮疾病活动指数；* P＜0.05；**P＜0.01 3. 讨论
本研究基于病例对照研究设计，探究了SLE患儿血清5种降解单糖水平变化特征及其临床意义，结果显示SLE组血清甘露糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖水平均高于对照组；对SLE患儿进行亚组分析后发现，甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖水平随疾病活动度增加而逐渐升高。相关性分析表明，血清降解单糖水平与SLEDAI评分及多种免疫指标存在正相关，提示血清降解单糖可能与SLE发病及病情进展具有关联性，为该病的病因学研究提供了数据支撑。
SLE是一种因机体免疫功能自稳机制紊乱而导致、以血清出现多种自身抗体为特征，可累及全身多器官、多系统的自身免疫性疾病。随着SLE治疗药物的不断涌现，特别是近年来以贝利尤单抗为代表的生物制剂的问世，SLE临床治疗效果大为提高，整体而言患者预后得到了明显改善，但由于SLE发病机制十分复杂，仍有部分患者对治疗药物不敏感，以致生活质量进行性下降甚至危及生命，且相较于成人SLE患者，SLE患儿的疾病活动度更高、脏器损害更为广泛且严重[14-15]。有资料显示，SLE患儿10年累积死亡率约为10%[16]。因此，进一步阐明SLE发病机制，特别是探寻免疫稳态失衡的原因仍十分必要。
糖组学是当前生物学领域的新兴学科，主要研究聚糖在生物体内的结构和功能。聚糖为生物体重要的组成成分，类似于核酸、蛋白质，其蕴含非常丰富的生物学信息[17]。聚糖分子的形成不受基因编码的直接调控，而是在糖基转移酶的催化下，糖链与蛋白质或脂质相结合形成糖蛋白或糖脂，该过程即为糖基化[18]。糖基化修饰几乎参与了机体所有生物学过程，尤其在免疫调节中发挥重要作用[19]。如IgG介导的抗炎作用可通过其Fc片段与B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞等免疫细胞表面Fc受体相结合而实现，具体机制与Fc片段的唾液酸化(糖基化的一种类型)抑制了自身抗体所致的免疫反应有关[20-21]。Cheng等[22]研究发现，相较于正常人群，幼年特发性关节炎患者IgG的Fc片段半乳糖基化与唾液酸化水平均降低，提示Fc区域糖基化对于调节抗体对炎症的影响至关重要。既往研究发现，SLE患者IgG的Fc片段半乳糖基化和唾液酸化异常与血清抗核抗体水平及器官受累呈正相关[7]，血清IgG岩藻糖基化水平升高与SLE疾病活动度相关[23]。Szabo等[24]研究发现，SLE患者效应T细胞表面N-糖基化的改变不利于其与半乳糖凝集素1相结合，进而抑制Th1/Th17凋亡，对SLE患者T细胞分化失调产生直接影响，可能参与了SLE发病的调节。上述研究提示，糖基化与包括SLE在内的自身免疫性疾病的发生发展密切相关。
虽然聚糖结构的复杂性以及糖基化过程较强的随机性导致直接分析SLE患儿的聚糖变化特征难度较大，但聚糖由单糖组成，而单糖的成分却相对单一，主要包括10种单糖，即甘露糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖和唾液酸。上述单糖中能在血清独立存在的称为游离单糖(如甘露糖、葡萄糖等)，聚糖经酸解后检出的单糖称为降解单糖(如甘露糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖)，其中甘露糖和葡萄糖既可以游离单糖的形式存在，又可以降解单糖的形式存在。由于降解单糖是人为将聚糖分解后所产生的单糖[25]，相较于游离单糖，降解单糖水平一定程度上可反映聚糖数量和结构变化。本研究采用盐酸降解血清聚糖后通过HPLC技术对洗脱的降解单糖进行检测，以探究血清降解单糖与SLE的相关性。
本研究团队在前期实验中发现葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖、岩藻糖水平在SLE患儿与健康人群之间无显著差异，而唾液酸血清含量极低，检测难度大，故本研究对甘露糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖5种降解单糖进行了检测。结果显示，SLE组此5种降解单糖水平均明显高于对照组；对SLE患儿组内比较后发现，甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖水平随疾病活动度增加而逐渐升高，提示血清降解单糖可能参与了SLE发病及病情进展。SLE患儿体内存在广泛的免疫紊乱，多数免疫相关分子属于糖蛋白，且免疫细胞表面的受体亦多数为糖蛋白结构。降解单糖水平的差异提示SLE患儿体内糖蛋白糖基化水平的改变。推测免疫相关重要蛋白糖基化异常引起的免疫失衡可能在SLE发生、发展中起重要作用，但具体作用机制尚不清楚，可能在糖基化酶基因多态性遗传背景的基础上，糖基化酶表达水平和功能异常可使蛋白分子糖基化发生内在缺陷，进而导致机体免疫调节功能失衡，促进SLE发病。
相关性分析显示，5种血清降解单糖与多种免疫指标具有正相关性，如甘露糖、氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖均与SLEDAI评分呈正相关，甘露糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖均与B淋巴细胞计数呈正相关，甘露糖、氨基葡萄糖、半乳糖均与IgG水平呈正相关，提示血清降解单糖一定程度上可反映SLE患儿免疫功能紊乱程度，在病情监测、预后评估中具有潜在的应用价值。
本研究局限性：(1)虽然研究对象均设定了严格的纳入与排除标准，且对照组采用了年龄、性别与SLE患儿相匹配的方式入组，但仍不排除研究结果会受到其他干扰因素的影响；(2)对相关作用机制缺乏深入探讨；(3)受病例对照研究固有局限性的影响，暂无法明确血清降解单糖变化与SLE的因果关系。
综上所述，SLE患儿血清5种降解单糖水平升高且部分降解单糖与疾病活动度及免疫功能紊乱具有相关性，但确切结果仍需大样本前瞻性研究进一步验证。本研究初步揭示了血清降解单糖与SLE的相关性，可为后续SLE病因学研究及相关作用机制分析提供借鉴。
作者贡献：徐英春、瞿介明牵头制定共识框架；王瑶负责共识提纲编制，组织协调专家组成员对内容进行修订并组织会议讨论；陈新飞、沈宁、苏欣、吴文娟、王瑶、王一民、奕巧莲、张栋、张静、周华、周敏负责撰写共识草案；陈新飞、奕巧莲负责对专家意见进行汇总，并对共识内容进行完善；徐英春、瞿介明负责对共识全文进行最终审校并形成共识终稿。利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突撰写专家组 (按姓名首字母排序)：陈培松(中山大学附属第一医院)，陈雨(中国医学科学院北京协和医院)，韩崇旭(江苏省苏北人民医院)，刘勇(中国医科大学附属盛京医院)，瞿介明(上海交通大学医学院附属瑞金医院)，魏莲花(甘肃省人民医院)，王毅(天津市天津医院)，徐英春(中国医学科学院北京协和医院)，余方友(同济大学附属上海市肺科医院)，朱迎钢(复旦大学附属华东医院)评审专家组 (按姓名首字母排序)：柴凤霞(酒泉市人民医院)，陈发林(福建省临床检验中心)，陈国强(黄冈市中心医院)，陈康(广东省中山市人民医院)，陈丽萍(牡丹江市第一人民医院)，程歆琦(中国医学科学院北京协和医院)，程训民(淮北市人民医院)，戴二黑(石家庄市第五医院)，丁大朋(大连医科大学附属第一医院)，丁志明(大同市第五人民医院)，冯磊(云南省玉溪市人民医院)，甘建玲(萍乡市妇幼保健院)，高波(鹤岗市人民医院)，关秀茹(哈尔滨医科大学附属第一医院)，郭珊(新乡市中心医院)，郭玮(复旦大学附属中山医院)，郭小英(青海省妇女儿童医院)，纪玲(北京大学深圳医院)、贾伟(宁夏医科大学总医院)，姜玉章(南京医科大学附属淮安第一医院)，柯江维(江西省儿童医院)，类承斌(淄博市中心医院)，李辉(新疆医科大学第一附属医院)，李杰(天水市第一人民医院)，李娜(沈阳市儿童医院)，李启欣(佛山市第一人民医院)，李士军(大连医科大学附属第一医院)，李一荣(武汉大学中南医院)，李子安(青海省人民医院)，梁红萍(山西省人民医院)，林燕(赣州市人民医院)，刘家云(空军军医大学西京医院)，刘靳波(西南医科大学附属医院)，刘荣华(临汾市中心医院)，刘双全(南华大学附属第一医院)，刘治娟(西藏自治区人民医院)，卢文波(宁波市妇女儿童医院)，罗春华(宜昌市中心人民医院)，马筱玲(中国科技大学附属第一医院)，马艳侠(陕西中医药大学医学技术学院)，梅世月(河南省儿童医院)，闵迅(遵义医科大学附属医院)，穆红(天津市第一中心医院)，秦晓松(中国医科大学附属盛京医院)，屈涛(新疆喀什地区第二人民医院)，屈晓威(延安大学附属医院)，邵雪君(苏州大学附属儿童医院)，沈瀚(南京大学医学院附属鼓楼医院)，孙磊(长治市人民医院)，孙世珺(中山市人民医院)，邰文琳(昆明医科大学第二附属医院)，谭黎明(湖南省人民医院)，唐石伏(柳州市人民医院)，唐翌姝(重庆医科大学附属第一医院)，陶志华(浙江大学医学院附属第二医院)，王万俊(安庆市第一人民医院)，王彦(河北大学附属医院)，王艳海(呼和浩特市第一医院)，王颖君(内蒙古医科大学附属医院)，吴永彬(广西壮族自治区南溪山医院)，肖美芳(海南省妇女儿童医学中心)，肖敏敏(芜湖市第二人民医院)，阳文辉(广西壮族自治区人民医院)，杨天赐(厦门大学附属中山医院)，易斌(中南大学湘雅医院)，应斌武(四川大学华西医院)，尤崇革(兰州大学第二医院)，张华(贵州省人民医院)，张丽娜(大庆油田总医院)，张晓丽(重庆医科大学附属永川医院)，张新(新疆生产建设兵团医院)，赵笑梅(吉林市中心医院)，郑磊(南方医科大学南方医院)，郑秀霞(商丘市第一人民医院)，朱鹏飞(郑州大学第一附属医院)，朱召芹(上海市公共卫生临床中心)执笔人 (按姓名首字母排序)：陈新飞(中国医学科学院北京协和医院)，沈宁(北京大学第三医院)，苏欣(南京大学医学院附属鼓楼医院)，吴文娟(上海市东方医院同济大学附属东方医院)，王瑶(中国医学科学院北京协和医院)，王一民(中日友好医院武汉市金银潭医院)，奕巧莲(中国医学科学院北京协和医院)，张栋(中国医学科学院北京协和医院)，张静(复旦大学附属中山医院)，周华(浙江大学医学院附属第一医院)，周敏(上海交通大学医学院附属瑞金医院) -
表 1 《成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识(2023)》核心推荐意见
分类 具体推荐意见 共识度 基于核酸检测技术 实时荧光PCR 实时荧光PCR包括单靶标或多靶标呼吸道病原体核酸检测，可作为核酸即时检测的参考方法，主要适用于门急诊、住院患者和大规模人群筛查 95.2% 等温扩增 等温扩增耗时短、扩增效率高，通常以核酸即时检测的形式出现，适用于门急诊、发热门诊呼吸道感染患者病原体核酸快速筛查 96.4% 数字PCR 数字PCR可直接定量检测呼吸道标本中病原体数目，适用于低浓度样本、低丰度基因或突变基因的检测，可作为其他核酸检测方法的检测限标定 94.0% 核酸即时检测 核酸即时检测主要适用于检测场地有限或需要快速筛查的发热门诊、急诊、ICU等呼吸道感染患者的特定病原体检测 97.6% 病原体高通量测序 病原体高通量测序在传统微生物检验未能明确病原或急需快速鉴别是否感染及其病原体时，有选择地使用，主要适用于呼吸道重症感染、疑似特殊病原体感染、聚集性呼吸道传播性感染患者 98.8% 基于应用场景 急性上呼吸道感染高危人群(老年人、儿童、孕产妇、合并基础疾病的患者)和气管支气管炎患者 建议在流感病毒、新型冠状病毒等流行季节和高风险地区，进行病原体核酸即时检测，以鉴别诊断、缩短患者就诊时间、降低病原体传播风险 100% 免疫功能正常、存在住院风险的气管支气管炎成人患者 建议采用多靶标病原体核酸检测技术明确病原，以缩短抗生素使用时间和患者住院时间 98.8% 社区获得性肺炎患者 建议对社区获得性肺炎重症患者同时行常规病原学检查和核酸检测，以提高病原体检出率 100% 医院获得性肺炎和呼吸机相关性肺炎患者 病原学诊断应以传统培养方法为主，必要时联合采用多靶标病原体核酸检测，无需常规行mNGS，仅在患者存在免疫缺陷、3 d内未通过传统微生物检验明确病原体且经验性抗感染治疗无效时，考虑行以DNA测序为主的mNGS 96.4% 慢性阻塞性肺疾病急性加重患者 不建议常规行流感病毒、新型冠状病毒等呼吸道病毒核酸筛查，仅对有流行病学史、流感样症状或病情严重需住院治疗的患者进行核酸检测 86.7% 肺结核患者 推荐常规行结核分枝杆菌涂片、培养和核酸检测，mNGS与结核特异性PCR对结核分枝杆菌诊断能力相似 97.6% 结核性胸膜炎患者 建议行胸水和胸膜组织的结核分枝杆菌培养和核酸检测 97.6% 可疑活动性结核患者 对涂片抗酸染色阴性患者，至少行1次呼吸道标本的结核分枝杆菌核酸检测；对涂片抗酸染色阳性患者，核酸扩增技术可鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌 94.0% 免疫功能受损合并肺部感染患者 推荐同时行血和支气管肺泡灌洗液标本mNGS，必要时行组织标本mNGS 97.6% 造血干细胞及实体器官移植后患者 推荐定期采用数字PCR进行病毒(包括巨细胞病毒和其他呼吸道病毒)的定量、动态检测 94.0% PCR：聚合酶链反应；mNGS：宏基因组高通量测序 
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表 2 呼吸道病原体核酸检测技术比较
检测技术 性能特征 应用场景 有无商品化试剂 实时荧光PCR 病原体：单一
通量：批测试，高
检出限：100~1000拷贝/mL
TAT：约1.5~3 h门急诊检查，大规模人群筛查 有 多重PCR 病原体：数个至数十个
通量：批测试，中等
检出限：1000拷贝/mL
TAT：约1.5~3 h流行病学调查，医院获得性重症肺炎/社区获得性肺炎/混合感染诊断 有 等温扩增 病原体：1个至数个
通量：不确定
检出限：100~1000拷贝/mL
TAT：约0.5~1.5 h发热门诊，急诊，即时检测 有 数字PCR 病原体：1个至数十个
通量：4~7个标本
检出限：1拷贝/mL
TAT：约3~4 h定量检测，疗效评估，环境检测，参考品或标准品定标 有 核酸即时检测 病原体：1个至数个
通量：不确定
检出限：100~1000拷贝/mL
TAT：约0.5~1.5 h发热门诊，急诊，床旁检测 有 mNGS 病原体：未知、不限
通量：10~16/芯片
检出限：约1000拷贝/mL
TAT：约18~24 h传统病原学检测无法诊断的疑难重症病例 暂无 tNGS 病原体：数十至数百个已知病原微生物及其毒力和/或耐药基因
通量：不确定
检出限：25~500拷贝/mL
TAT: 约18~24 h门急诊，发热门诊，普通病房，ICU，反复呼吸系统感染查因 暂无 PCR、mNGS：同表 1; TAT：检验结果回报时间; tNGS: 多重病原体靶向测序
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感染类型/人群 病原体 核酸检测技术 标本 送检条件 急性上呼吸道感染 病毒为主：鼻病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、冠状病毒等；细菌少见：化脓链球菌、白喉棒状杆菌、溶血隐秘杆菌、淋病奈瑟菌等；化脓性感染考虑厌氧菌 单靶标实时PCR、多重实时PCR、微流控芯片、mNGS、tNGS 口腔拭子、口咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽抽吸液、鼻咽洗液、上颌窦穿刺及抽吸液 病毒检测：病毒转运培养基，2~8 ℃转运；
细菌检测：常温，转运时间≤2 h气管支气管炎 呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人偏肺病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体等 单靶标实时PCR、多重实时PCR、微流控芯片 鼻咽拭子、鼻咽抽吸液、鼻咽洗液 病毒转运培养基，2~8 ℃转运 社区获得性肺炎 肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、金黄色葡萄球菌、呼吸道病毒、军团菌、诺卡菌、放线菌等 多重实时PCR、微流控芯片、tNGS、mNGS 痰、诱导吸痰、气管支气管吸取物、BALF、肺活检组织、胸水 细菌检测：常温，转运时间≤2 h；病毒检测：病毒转运培养基，2~8 ℃转运 医院获得性肺炎/呼吸机相关性肺炎 多重耐药革兰阴性菌：肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、其他肠杆菌目细菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌等；甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌等 多重实时PCR、微流控芯片；必要时tNGS、
mNGS同上 常温，转运时间≤2 h 慢性阻塞性肺疾病急性加重 常见：流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌目细菌等；
少见：肺炎衣原体、肺炎支原体、军团菌、金黄色葡萄球菌等多重实时PCR、微流控芯片、tNGS、mNGS 痰、诱导吸痰、气管支气管吸取物、BALF 常温，转运时间≤2 h 肺结核 结核分枝杆菌；与非结核分枝杆菌鉴别 实时PCR；微流控芯片、tNGS、mNGS 痰、诱导吸痰、气管支气管吸取物、BALF、肺活检组织、胸水 常温，转运时间≤2 h 恶性肿瘤患者 免疫正常人群常见的呼吸道病原体；产ESBL菌、诺卡菌、结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、巨细胞病毒、曲霉和隐球菌、耶氏肺孢子菌等感染几率更高 单靶标实时PCR、多重实时PCR、微流控芯片、tNGS、mNGS 痰、诱导吸痰、气管支气管吸取物、BALF、肺活检组织、胸水 常温，转运时间≤2 h 干细胞及器官移植患者 免疫正常人群常见的呼吸道病原体；结核分枝杆菌、巨细胞病毒、曲霉和隐球菌、耶氏肺孢子菌等感染几率更高 同上 同上 同上 免疫相关性疾病患者 可能合并多种条件致病菌或序贯出现不同病原体感染，包括曲霉菌、念珠菌、巨细胞病毒、耶氏肺孢子菌等 同上 同上 同上 HIV感染者 CD4+T淋巴细胞＜200/mL或临床诊断艾滋病者更易感染肺孢子菌、结核分枝杆菌、隐球菌等；CD4+ T淋巴细胞计数正常者更易感染肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、需氧革兰阴性杆菌、结核分枝杆菌等 同上 同上 同上 PCR、mNGS：同表 1；tNGS：多重病原靶向测序；BALF：支气管肺泡灌洗液；ESBL：超广谱β-内酰胺酶；HIV：人类免疫缺陷病毒
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