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Expression of Perforin in the Peripheral Blood of Patients with Primary Biliary Cirrhosis and Its Clinical Significance
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摘要:目的 研究原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)患者外周血穿孔素(perforin, 又称pore-forming protein, PFP)的表达, 探讨PFP在PBC发病机制中的作用及其临床意义。方法 应用荧光定量PCR检测86例PBC、56例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis type B, CHB)和69名健康对照者的外周血单个核细胞(peripheral bloodmono nuclear cells, PBMCs)中PFP mRNA基因表达的差异; 采用流式细胞术分别检测CD3-CD56+自然杀伤细胞(natu-ral killer cells, NK)、CD3+CD8+细胞毒性T细胞(cytotoxic Tlymphocytes, CTL)和CD3+CD56+自然杀伤性T细胞(natural killer Tlymphocytes, NKT)的PFP蛋白表达量。结果 PBC组PBMCs中PFP mRNA基因表达较健康对照者升高(P < 0.05);PBC、CHB患者和健康对照者NK、CTL和NKT占PBMCs的比例无明显差别(P>0.05), PBC患者NK、CTL和NKT中表达PFP蛋白的细胞较健康对照者明显升高(P < 0.01)。PFPmRNA基因表达量及NK、CTL和NKT表达PFP蛋白的细胞比例与PBC患者Mayo危险评分呈显著负相关(P < 0.01), PBC患者总胆红素水平与NK、CTL表达PFP蛋白的细胞比例呈负相关(P < 0.05)。结论 PBC患者PFP的异常表达, 提示PFP可能参与PBC的发病。PBC患者NK、CTL和NKT表达PFP蛋白的细胞比例可做为PBC患者生存预后的有效指标。Abstract:Objective To study the expression of perforin (also known as pore-forming protein, PFP) in the peripheral blood of patients with primary biliary cirrhosis (PBC) and to analyze the clinical significance of PFP in the pathogenesis of PBC.Methods Peripheral blood mononuclear cells PFP mRNA were detected by real-time RT-PCR assay in 86 PBC patients, 56 chronic hepatitis B patients, and 69 health controls. The expressions of PFP protein in CD3-CD56+natural killer cells (NK), CD3+CD8+cytotoxic T lymphocytes (CTL), and CD3+CD56+natural killer T lymphocytes (NKT) were examined by tricolour flow cytometry.Results The mRNA expression of PFP was significantly higher in PBC patients (P < 0.05). The percentage of lymphocyte subsets was not significantly different among the three groups (P>0.05), while the percentage of PFP in the three lymphocyte subsets in PBC patients was significantly higher than those in health controls (P < 0.01). The Mayo risk score was significantly correlated with the gene expression of PFP and the percentage of PFP in three types of cells in PBC patients (P < 0.05). The percentage of PFP in NK and CTL cells were also positively correlated with the levels of total bilirubin in PBC patients (P < 0.05).Conclusions PFP shows abnormal expression in PBC patients, suggesting that PFP may be involved in the pathogenesis of PBC. The percentages of PFP-positive NK, CTL, and NKT cells can be used as effective indicators in predicting the survival of PBC patients.
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原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是以肝脏内小叶间胆管非化脓性炎症损害为主的自身免疫性疾病, 疾病终末期出现肝纤维化及肝硬化。PBC确切的发病机制至今未明。近年来, 有关PBC靶器官损伤以及疾病特异性自身抗体-抗线粒体抗体(anti-mitochondrial antibody, AMA)产生的凋亡机制得到广泛研究[1-2]。穿孔素(perforin, 又称pore-forming protein, PFP)是由细胞毒性细胞, 如自然杀伤细胞(natural killer cells, NK)、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)及自然杀伤性T细胞(natural killer T lymphocytes, NKT)等分泌的效应分子, 能在靶细胞上形成跨膜的孔道, 使颗粒酶进入靶细胞胞浆, 由此启动凋亡信号通路。同时, PFP也是免疫调节的重要分子。本文对PBC患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) PFPmRNA基因的表达及NK、CTL和NKT细胞中PFP蛋白的表达进行研究, 探讨PFP在PBC发病中的作用及临床意义。
对象和方法
对象
86例PBC患者均来自2009年11月至2010年5月就诊于北京协和医院风湿免疫科门诊或住院患者, 56例疾病对照组选取北京佑安医院就诊的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis type B, CHB)患者, 69名健康对照(health control, HC)者均来自健康体检志愿者。PBC患者符合美国肝脏病学会2009年制定的PBC诊疗指南[3](表 1)。
表 1 原发性胆汁性肝硬化患者及对照者基本资料
主要试剂
提取细胞总RNA的Trizol试剂购自Invitrogen公司, 反转录及荧光定量PCR (SYBR法)试剂盒购自日本Takara公司, 流式细胞术检测中的荧光标记抗体APC-anti-CD3抗体、FITC-anti-CD8抗体、FITCanti-CD56抗体和PE-anti-perforin抗体均为美国eBioscience公司产品。
方法
实时荧光定量PCR检测PBMCs中PFPmRNA基因的表达:提取细胞总RNA, 反转录合成cDNA, 采用SYBR染料法实时荧光定量PCR检测PBMCs中PFPmRNA基因的表达。采用DNAMAN软件设计反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)所用引物, 以http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网站验证引物的特异性, 引物由Invitrogen公司合成, 目的基因PFP引物序列如下, 上游:5 '-CGCTTCTACAGTTTC CATGTGG 3', 下游:5 '-TGCCGTAGTTGGAGATAAG CC-3';管家基因采用甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAP DH), 序列如下, 上游:5'-TCGGAGTCAACGGATTT GGTC 3', 下游:5 '-GCCATGGGTGGAATCATATTGG 3 '。实时荧光定量PCR采用BIO-RAD公司IQ5荧光定量PCR仪检测, 反应条件:95℃ 10 s → (95℃ 5 s → 60℃ 20 s) ×40个循环→95℃ 15 s →65℃ 15 s → 95℃ 15 s →4℃终止反应。PCR产物特异性经琼脂糖凝胶电泳和熔解曲线分析确定。采用Bio-Rad iQ5 Optical System Sotware进行荧光定量操作及数据分析, 患者与疾病对照组、健康对照组PFP mRNA基因表达水平用相对定量法2-ΔΔCt计算。
流式细胞仪检测PBMCs中各细胞亚群PFP蛋白的表达:首先进行细胞表面分子染色, 制备PBMCs悬液, 用磷酸盐缓冲液(PBS)调整细胞浓度至1 × 10 6 /ml, 阻断非特异染色后加入APC-anti-CD3和FITC-anti-CD8抗体各20 μl, 另一管加入APC-anti-CD3和FITC-anti-CD56各20μl, 4℃避光孵育30mi n。然后进行细胞内PFP蛋白的荧光抗体染色, 加入含0. 5%胎牛血清白蛋白的PBS洗涤细胞离心后加入1 ml细胞固定液, 振荡混匀, 室温避光孵育20 mi n, 孵育后加入1 ml预配好的破膜打孔液避光孵育10 mi n, 洗涤后加入PE-anti-perforin抗体, 4℃避光孵育30 mi n。孵育后重复洗涤离心2次, 用PBS重悬细胞沉淀, 采用美国Accuri公司C 6流式细胞仪进行检测。CFlow软件进行流式细胞术的检测及数据分析。
统计学处理
数据的统计学分析采用SPSS13.0统计软件。年龄及肝功能指标采用中位数表示, 计量资料用$ \overline x \pm s $表示, 计数资料采用百分数表示, 两组间计量资料的比较用Independent-sample t检验, 相关系数分析采用Spearson秩相关分析。所有检验均为双侧检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。
结果
PCR产物鉴定
PCR扩增产物经凝胶电泳成像显示, 目的片段大小和预期设计相符, 扩增条带单一, 无杂带(图 1)。
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图 1 PFP基因和GAPDH基因扩增产物凝胶电泳图1~3.PFP基因扩增产物；4~6. GAPDH基因扩增产物；PFP：穿孔素；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；M：标准参照物PCR扩增曲线
GAPDH和PFP的PCR产物的动态扩增曲线均为S型, GAPDH的Ct值小于20, PFP的Ct值小于25 (图 2), 表明PCR产物扩增曲线荧光信号良好。
PCR扩增产物的特异性
将GAPDH和PFP的PCR扩增产物进行熔解曲线分析, 熔解曲线出现两个明显的主峰, 无杂峰(图 3), 表明无非特异性扩增产物及引物二聚体。
PBMCs中PFPmRNA基因的表达
PBC组PBMCs中PFPmRNA表达(1. 29 ±1. 26)较HC组(0. 98 ±0. 56)明显升高, 差异有统计学意义(P=0. 041);而CHB组的PFP表达(2. 50±1. 89)较PBC组和HC组更高, 差异具有显著统计学意义(P < 0. 01)。
流式细胞术检测PBMCss各细胞亚群及PFP蛋白表达
PBC、CHB和HC组外周血NK、CTL和NKT细胞所占PBMCs的比例, 均无明显差异。PBC组NK、CTL和NKT细胞中表达PFP蛋白的细胞与HC组比较, 差异有显著统计学意义(P < 0. 01);CHB组NK和CTL中表达PFP蛋白的细胞与HC组比较差异有统计学意义(P < 0. 05), 而NKT中表达PFP蛋白的细胞与HC组比较则差异无统计学意义(图 4, 表 2)。
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图 4 流式细胞术检测PBMCs中PFP蛋白表达A.以PBMCs中CD3-细胞圈门，CD3-CD56+NK细胞PFP的表达；B.以PBMCs中CD3+细胞圈门，CD3+CD56+NKT细胞PFP的表达；C以PBMCs中CD3+CD8+CTL细胞PFP的表达PBMCs：外周血单个核细胞；PFP同图 1表 2 外周血PF P蛋白表达(%, $ \overline x \pm s $)
PBC患者PFPmRNA基因及蛋白表达与肝脏功能指标的相关性
PBC患者PFPmRNA基因及蛋白表达水平, 均与ALT、GGT、AST及ALP无相关性。CD 3-CD 56 + NK、CD 3 +CD 8 +CTL及CD 3 +CD 56 +NKT细胞中表达PFP蛋白的比例均与May o危险评分呈显著负相关(P < 0. 01), CD 3-CD 56 +NK及CD 3 +CD 8 + CTL细胞表达PFP蛋白的比例与TBi l水平呈负相关(图 5)。
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图 5 PBC患者PFP mRNA基因表达的量、PFP蛋白表达比例与肝脏功能相关指标的相关性A. PFP mRNA基因表达量与MRS相关性；B. NK细胞表达PFP蛋白比例与MRS相关性；C NK细胞表达PFP蛋白比例与TBil相关性；D. CTL细胞表达PFP蛋白比例与MRS相关性；E. CTL细胞表达PFP表达PFP蛋白比例与TBil相关性；F. NKT细胞表达PFP蛋白比例与MRS相关性；采用Spearson秩相关分析讨论
细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤性细胞(NK)分别是适应性免疫和天然免疫的代表, 能在疾病的不同阶段发挥免疫作用参与疾病的发生和发展。CTL /NK细胞的免疫活动主要依赖其胞内的分泌颗粒[4]。分泌颗粒内含有大量的蛋白酶、溶酶体, PFP和颗粒酶就位于其中。PFP是PFPmRNA基因编码的相对分子质量为66 000的蛋白, 当CTL细胞被激活后, 其被释放到靶细胞细胞膜, 形成含有12 ~ 16个多聚穿孔素孔道, 颗粒酶经PFP通道进入靶细胞内, 启动一系列级联反应, 引发靶细胞凋亡[5]。颗粒酶若非经PFP通道进入靶细胞, 如内吞或扩散作用进入, 则不会导致细胞的凋亡[6]; 另有研究发现PFP基因敲除的动物模型完全丧失了分泌颗粒依赖细胞毒的功能, 而颗粒酶基因敲除的动物模型仅有轻微的功能丧失, 这表明PFP是CTL /NK细胞发挥凋亡及细胞毒作用的关键[7]。
本研究发现PBC患者PBMC中PFPmRNA基因表达量与HC组相比明显升高(P=0. 041), 升高的原因可能是表达PFP的细胞数量增加或功能增强。进一步分析外周血中表达PFP蛋白的细胞亚群, 发现PBC患者CTL、NKT和NK细胞所占PBMCs的比例均高于HC组, 但差异无统计学意义, 说明PFP在PBC中表达的增加并非因为细胞比例差异引起。
CTL /NK细胞介导细胞毒作用主要依赖两个机制:PFP、颗粒酶介导的细胞杀伤和FasL、TRAIL依赖受体介导的细胞凋亡。Chuang等[8]在PBC患者胆管上皮细胞中观察到前者表达显著增加, 而后者的表达则与正常对照组无明显差异[9]。本研究结果显示外周血NK细胞PFP蛋白表达增高, 表明功能加强的NK细胞能更有效的募集到肝脏, 加剧肝脏的损害。天然免疫可以其应答迅速、作用非特异性率先对异常现象作出反应; 同时, NK细胞也能通过释放I FN -γ、TGF β、I L 8等细胞因子调节适应性T细胞的免疫功能[10-11], 协助后续的免疫耐受破坏和疾病维持[12]。适应性免疫通常在天然免疫发生后48 h迁移至炎性部位, CTL细胞是适应性免疫的重要行使者。PBC患者肝组织病理学研究显示, 浸润胆管的CD 8 +T细胞PFP蛋白表达率达100% [13]。而本实验观察到PBC患者外周血CTL细胞PFP表达均高于CHB患者及健康对照组(P < 0. 05), 提示PBC患者外周循环的CTL有选择性的进入肝脏行使免疫功能, 有效的保证活化的CTL发挥细胞毒功能。
本研究发现CTL /NK细胞PFP的表达和PBC患者体内肝酶及胆酶的含量无相关性, 而与反应患者生存预后的TBi l水平及Mayo危险评分呈显著负相关, 分析原因可能是: (1) PBC的早期病理改变以肝脏小胆管自身免疫反应为主, 浸润小胆管周围的Th1型细胞能释放IL-2, IFN-γ、TNF-β等细胞因子而活化CTL /NK细胞[14], 另外树突状细胞也能和NK细胞相互作用激活NK细胞[15-16], 这就使得大量激活的CTL /NK细胞表达PFP, 加剧小胆管及肝细胞的损害。而PBC晚期肝脏发生不可逆转的肝纤维化及肝硬化, 肝脏微环境的改变导致CTL /NK细胞活化程度降低, PFP表达减少, 呈现出和疾病严重性负相关的关系。(2) PBC中NK细胞可能也同时作用于已受损的小胆管上皮细胞, 对这些受损细胞从机体的清除起到促进作用, 该结果也符合目前认为NK细胞具有保护性和致病性双重功能的观点[17]。
Padgett等[18]通过分析N. aromaticivorans细菌的编码蛋白, 发现它们和人类线粒体抗原PDC-E 2具有同源性, 并且还包含了一个能被AMA阳性血清识别的硫辛酰功能区, 能与特异性线粒体抗原的单抗发生反应, 从而提出了N. aromaticiorans具有打破遗传易感性个体自身耐受, 导致PBC发病的可能性。随后, 有学者证实此细菌诱导机体产生AMA和慢性的T细胞介导自身免疫性小胆管炎的始发者就是NKT细胞[19]。NKT细胞是T淋巴细胞的一个亚群, 在天然免疫反应调节中具有重要作用。NKT细胞被认为能同时表达T淋巴细胞表面标记物, 如CD 3, 以及NK细胞表面标记物, 如CD 56, CD 57或CD 161。本研究选择CD 3和CD 56对NKT细胞进行标记。结果显示PBC患者此群细胞所占比例与健康对照组相比有所升高, 但差别无统计学意义。Kita等[20]观察到PBC患者外周血及肝脏NKT细胞数量均有升高, 但肝脏中的升高更显著, 提示外周血NKT可能迁移或募集至肝脏参与靶器官的损伤, 使得外周血的变化不明显。NKT细胞表达PFP蛋白的细胞比例高于健康对照组(P < 0. 01), 并且和Mayo危险评分有显著的相关性, 提示PFP在NKT参与炎性应答、胆管破坏及介导PBC发病中起到一定作用, 该结果也能为NKT细胞造成PBC肝损伤这一观点做出佐证。
PBC的发病是复杂的多阶段模型:首先某种原因导致胆管上皮细胞病变, 数目减少, 胆管上皮细胞的损伤导致PDC -E 2表达类型改变; 然后变化了的PDC -E 2作为自身抗原引起继发性免疫反应, 胆管数进一步减少; 最后胆管损伤引起的胆汁淤积引发进一步胆管上皮细胞病变[21]。然而PFP表达的异常究竟是导致PBC发病的原因, 还是疾病炎性应答的效应机制, 这还需要进一步研究证实。总之, 本研究结果显示PBC患者PFP基因及蛋白表达异常, 表明PFP在PBC的发病机制中起到一定的作用。NK、CTL和NKT细胞表达PFP的比例可以作为PBC患者生存预后的有效指标。
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图 1 PFP基因和GAPDH基因扩增产物凝胶电泳图
1~3.PFP基因扩增产物；4~6. GAPDH基因扩增产物；PFP：穿孔素；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；M：标准参照物
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图 4 流式细胞术检测PBMCs中PFP蛋白表达
A.以PBMCs中CD3-细胞圈门，CD3-CD56+NK细胞PFP的表达；B.以PBMCs中CD3+细胞圈门，CD3+CD56+NKT细胞PFP的表达；C以PBMCs中CD3+CD8+CTL细胞PFP的表达PBMCs：外周血单个核细胞；PFP同图 1
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图 5 PBC患者PFP mRNA基因表达的量、PFP蛋白表达比例与肝脏功能相关指标的相关性
A. PFP mRNA基因表达量与MRS相关性；B. NK细胞表达PFP蛋白比例与MRS相关性；C NK细胞表达PFP蛋白比例与TBil相关性；D. CTL细胞表达PFP蛋白比例与MRS相关性；E. CTL细胞表达PFP表达PFP蛋白比例与TBil相关性；F. NKT细胞表达PFP蛋白比例与MRS相关性；采用Spearson秩相关分析
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