结直肠癌为临床常见恶性肿瘤之一, 在西方国家位列肿瘤死亡率的第2位, 在我国位列第4位。分子靶向治疗是结直肠癌除外科手术、放疗和化疗之外的一种新的治疗手段, 针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)胞外区的单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂已用于很多种实体瘤的治疗。EGFR是人类表皮生长因子受体酪氨酸激酶受体家族的成员, 在肿瘤生长、增殖、血管新生、侵袭转移过程中EGFR的激活都是非常关键的步骤, 目前EGFR已经成为肿瘤靶向治疗的重要靶点。研究表明EGFR过表达的肿瘤预后较差。表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)或其他配体和EGFR结合后通过多个渠道启动有丝分裂信号, 包括RAS-RAF-MAPK、PI3K、Akt和蛋白激酶C等。已经有3个抗EGFR的单克隆抗体应用于临床, 西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)和尼妥珠单抗(nimotuzumab)^[1]。西妥昔单抗是第一个被批准应用于临床治疗晚期结直肠癌的单克隆抗体, 它是一个人鼠嵌合的单克隆抗体; 帕尼单抗是一个完全人源化的单克隆抗体, 帕尼单抗比西妥昔单抗的免疫原性低。这两个药物单独或者联合化疗治疗晚期结直肠癌的安全性和有效性已经被大规模的临床试验验证, 单独治疗化疗耐药的EGFR过表达晚期结直肠癌反应率大约为10%^[2-3]。尼妥珠单抗治疗结直肠癌临床数据较少。分子靶向治疗药物的出现为复发转移性结直肠癌患者的治疗带来新的前景, 深入研究与分子靶向治疗药物疗效相关的分子标记物、个体化治疗, 不仅可提高治疗有效率, 延长患者的生存期、改善生活质量, 同时不会增加治疗相关毒性, 可减少不必要的医疗费用。

本文对晚期结直肠癌抗EGFR单克隆抗体靶向治疗生物标记物进行综述。

EGFR信号通路下游的信号分子突变

免疫组化法检测表明, 石蜡切片中肿瘤组织EGFR蛋白的表达与抗EGFR单克隆抗体治疗晚期结直肠癌的反应性无明显相关, 不是预测抗EGFR单克隆抗体治疗晚期结直肠癌的生物标志物^[1]。最近研究发现许多肿瘤由于EGFR信号通路下游某些信号分子突变, 可使信号通路持续活化刺激肿瘤生长。RAS-MAPK和PI3K信号通路在肿瘤发生中起着重要作用, 直接调控细胞的增殖、分化和凋亡。K-ras是一个癌基因家族, 其成员包括K-ras、H-ras和N-ras等, 编码GDP和GTP结合蛋白RAS, 在被GTP结合并激活后, RAS募集另外一个癌基因raf, RAF磷酸化MAP2K-1和MAP2K-2, 启动MAPK信号途径, 最终导致蛋白表达, 这个信号途径在细胞增殖、分化、存活中起着重要作用^[4-5]。癌基因PIK3CA编码p110蛋白的亚基PI3K, 也可以通过和RAS蛋白的互联作用被激活。所以无论EGFR是否活化或者是否被药物阻断, KRAS、BRAF或者PIK3CA突变都可以导致RAS、MAPK或者PI3K信号途径的下游处于持续的活化状态, 导致大量的癌基因转录, 比如MYC、CREB和NF-Kb^[4]。

K-ras突变

K-ras突变是目前研究最多的与EGFR靶向治疗预后相关的分子生物标志物, 并且被认为在抗EGFR单克隆抗体治疗晚期结直肠癌的预后分析中是一个独立的因素^[6]。NCICCO.17是由加拿大国立癌症研究所临床试验组(National Cancer Institute of Cancada Clinical Trials Group, NCIC CTG)和澳大利亚胃肠试验组织(Australasian Gastro-Intestinal Trials Group, AGITG)组织的国际Ⅲ期临床研究, 该研究是随机、开放、对照大样本研究^[7]。NCICCO.17研究的主要目的是探讨西妥昔单抗对化疗失败而不再接受化疗的晚期大肠癌患者的疗效。Karapetis等^[8]对NCICCO.17研究中K-ras基因突变状态与西妥昔单抗对总生存期(overall survival, OS)、无进展生存期(progression free survival, PFS)的影响进行了相关性分析, 同时对单纯接受最佳支持治疗患者的K-ras基因突变对OS、PFS的影响进行研究。入组患者572例, 394例进行K-ras检测, 两组均衡; K-ras突变型患者和K-ras野生型患者临床特点基本相似, 包括美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)评分, 以及多因素分析中的其他变量。K-ras基因突变患者的临床特点与全部患者也是相似的。结果显示:在接受K-ras基因突变检测的患者肿瘤组织标本中, K-ras基因突变发生率为42.3%, 表现为K-ras基因外显子2中至少有1个突变, 以G12D (35.7%)、G12V (28.1%)、G13D (11.7%)、G12S(9.9%)、G12A (6.4%)、G12C(5.3%)多见。西妥昔单抗的疗效与K-ras基因突变状态显著相关(K-ras基因突变状态与OS的相互作用分析结果为P=0.01, 与PFS的相互作用分析结果为P < 0.001)。在K-ras野生型患者中, 与单纯支持治疗相比, 使用西妥昔单抗治疗可显著改善OS (中位生存期为9.5个月比4.8个月, 死亡风险比为0.55;95%CI为0.41 ~ 0.74, P < 0.001), PFS(中位PFS为3.7个月比1.9个月; 病情进展或死亡的风险比为0.40;95%CI为0.30 ~ 0.54;P < 0.001)。在K-ras基因突变型患者中, 西妥昔单抗治疗组和单纯支持治疗组的OS(中位生存期4.5个月比4.6个月, 死亡风险比0.98;P=0.89)或PFS(中位PFS均为1.8个月, 风险比为0.99;P=0.96)无显著差异。在单纯接受最佳支持治疗的患者组中, K-ras基因的突变状态与OS无显著相关性(死亡风险比为1.01, P=0.97)。因此, K-ras基因突变的结直肠癌患者不能从西妥昔单抗的治疗中获益, 而K-ras野生型患者确实可以从西妥昔单抗治疗中获益。K-ras基因的突变状态对单纯接受最佳支持治疗患者的生存期没有影响。

2008年在美国临床肿瘤协会(American Society of Clinical Oncology, ASCO)会议上, K-ras基因突变的研究是大肠癌领域的研究热点。Bokemeyer等^[9]报告的随机II期OPUS试验回顾性分析, 探讨了西妥昔单抗联合FOLFOX方案一线治疗中K-ras基因突变与疗效的关系。337例EGFR表达阳性的转移性结直肠癌初治患者中, 233例检测K-ras基因, 其中134例(58%)为野生型, 99例(42%)为突变型。野生型患者西妥昔单抗联合FOLFOX有效率和PFS分别为61%和7.7个月, 单用FOLFOX方案分别为37% (P=0.011)和7.2个月(P=0.016);K-ras基因突变患者西妥昔单抗联合FOLFOX有效率和PFS分别为33%和5.5个月, 单用FOLFOX方案分别为49% (P=0.106)和8.6个月(P=0.0192)。该研究显示对K-ras野生型患者一线西妥昔单抗联合FOLFOX治疗能获得良好的疗效, 而K-ras突变患者加用西妥昔单抗治疗未见获益。Van Cutsem等^[10]对已完成的CRYSTAL研究进行深入的回顾性分析, 探讨西妥昔单抗联合FOLFIRI一线治疗中K-ras基因突变与疗效的关系。1198例EGFR表达阳性的转移性结直肠癌患者中540例检测了K-ras基因, 其中348例(64.4%)为野生型, 192例(35.6%)为突变型。野生型患者西妥昔单抗联合FOLFIRI有效率和PFS分别为59%和9.9个月, 单用FOLFIRI方案分别为43% (P=0.0025)和8.7个月(P=0.017); K-ras基因突变患者西妥昔单抗联合FOLFIRI有效率和PFS分别为36%和7.6个月, 单用FOLFIRI方案分别为40% (P=0.46)和8.1个月(P=0.47)。因此, 对野生型患者一线西妥昔单抗联合FOLFIRI治疗获得良好的疗效, 疾病进展危险性下降32%。

国内西妥昔单抗治疗结直肠癌的临床研究也有类似的结果。蒲兴祥等^[11]用含西妥昔单抗的化疗方案治疗晚期结直肠癌, 88例患者中44例进行K-ras检测, 45% (20例)有KRAS突变。突变型和野生型K-ras患者中位PFS分别为7.0和18.6周, 差异有统计学意义, 中位OS分别为15.2和17.3个月, 差异无统计学意义。庄荣源等^[12]发现在西妥昔单抗联合化疗治疗转移性结直肠癌的27例患者中, 12例为K-ras突变型患者; K-ras野生型患者PFS为8个月, 中位PFS为4个月。

显然国际和国内临床研究均表明, 只有K-ras野生型晚期转移性结直肠癌患者或西妥昔单抗单药治疗化疗失败而不再接受化疗的晚期大肠癌患者可从西妥昔单抗联合化疗一线治疗中获益。K-ras基因状态检测有助于确定西妥昔单抗的疗效, K-RAS是第1个可以预测晚期转移性结直肠癌患者将从靶向治疗药物西妥昔单抗中获益的生物标志物, 为个体化治疗方案的确定提供理论依据。2009年美国国家综合癌症网(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)结直肠癌指南中建议K-ras野生型晚期转移性结直肠癌患者一线治疗可以选择西妥昔单抗联合化疗。

B-raf突变

B-raf突变在结直肠癌中比较少见, 大约为15%。K-ras和B-raf突变在结直肠癌中经常是独立存在的。DeRoock等^[13]在1022例西妥昔单抗联合化疗治疗结直肠癌患者的研究中, 对761例检测了B-raf, 36例为突变型, 占4.7%;644例检测了N-ras, 17例为突变型, 占2.6%。K-ras野生型患者中B-raf突变和N-ras突变的患者对治疗的反应率较低, B-raf突变型患者治疗反应率是8.3%, 而B-raf野生型患者反应率是38%, N-ras突变型患者的反应率是7.7%, 野生型是38.1%。Di Nicolantonio等^[14]研究发现79例K-ras野生型结直肠癌患者中11例有B-raf突变, 这11例患者对西妥昔单抗或帕尼单抗的治疗没有反应, 而且PFS和OS明显比BRAF野生型患者短。

2010年NCCN结直肠癌指南中建议K-ras和Braf野生型晚期转移性结直肠癌患者一线治疗可以选择抗EGFR单抗联合化疗。

PIK3CA突变

在结直肠癌患者中PIK3CA突变率大约为20%, 与KRAS或者BRAF突变常同时存在。DeRoock等^[13]检测了743例患者的PIK3CA, 其中108例为突变型, 占14.5%;PIK3CA外显子9突变没有意义, 而外显子20突变的患者和野生型比较, 西妥昔单抗治疗效果较差, 突变型患者反应率是0%, 而野生型是36.8%, 突变型患者中位PFS是11.5周, 而野生型患者PFS是24周。Sartore-Bianchi等^[15]观察到PIK3CA突变型患者占结直肠癌患者的13.6%, PIK3CA突变与西妥昔单抗或者帕尼单抗耐药相关, PIK3CA突变患者对治疗的反应率是0;KRAS野生型患者中PIK3CA突变患者的PFS更短(P= 0.0035)。

PTEN突变

PTEN是调节PI3K-Akt信号途径的抑癌基因, PTEN丢失或者失活使患者对EGFR靶向治疗没有反应。一般结直肠癌患者中60% ~ 100% PTEN表达正常。Perrone等^[16]发现30例结直肠癌患者中有3例PTEN缺失(10%), 缺失者对西妥昔单抗治疗没有反应, 其中1例疾病进展(progessive disease, PD), 2例疾病稳定(stable disease, SD)。Razis等^[17]报道PTEN蛋白表达正常的患者使用西妥昔单抗的治疗疗效更好, PTEN正常患者治疗的反应率是42%, PTEN缺失患者治疗反应率是13%, PTEN正常患者疾病进展时间(time to progression, TTP)为7.41个月, PTEN缺失患者TTP为5.28个月。

EGFR基因状态

用免疫组化方法检测结直肠癌患者EGFR的表达与抗EGFR单抗治疗晚期结直肠癌的疗效无明显相关。但Shia等^[18]认为这可能是由于技术方面的原因造成, 如免疫组化方法不同, 或者抗EGFR的抗体不同, 以及处理肿瘤组织方法不同等。免疫组化是一个半定量的方法, 缺乏一个定量的评分系统, 其结果明显受到观察者主观因素的影响。此外, 肿瘤原发灶和转移灶的EGFR的表达是有差异的^[19]。EGFR状态和EGFR基因拷贝数和抗EGFR治疗的预后相关。

EGFR亲和性

Francoual等^[20]使用1种特殊的配体结合分析方法发现很多肿瘤既有低亲和力的EGFR, 也有高亲和力的EGFR:82个肿瘤样品中62个仅仅有高亲和力的结合位点(中位分离常数是0.75 nmol/L), 18个肿瘤样品同时有低亲和力和高亲和力位点。免疫组化的方法不能区别低和高亲和力EGFR, 这可能是EGFR免疫组化染色与EGFR靶向治疗疗效无关的原因。

EGFR基因拷贝数

EGFR基因拷贝数可以用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)或者原位杂交的方法检测, 部分结直肠癌患者EGFR基因拷贝数增加, Moroni等^[21]对应用西妥昔单抗或帕尼单抗治疗晚期结直肠癌患者采用FISH法检测EGFR基因拷贝数, 发现治疗有效的9例患者中8例EGFR拷贝数增加, 21例无效的患者中只有1例EGFR基因拷贝数增加。Personeni等^[22]用FISH法检测87例接受西妥昔单抗治疗的晚期结直肠癌患者的EGFR拷贝数, 发现EGFR基因拷贝数增加与西妥昔单抗治疗的反应性呈正相关, 并且发现EGFR拷贝数对预测西妥昔单抗治疗的反应性是独立于KRAS突变的一个因素。但是当用PCR方法确定EGFR基因拷贝数时, 所得到的基因拷贝数量和帕尼单抗或者西妥昔单抗治疗的反应性无关。Lenz等^[23]用PCR法检测34例患者的EGFR拷贝数, 发现EGFR拷贝数与PFS无关, 这可能是由于在DNA提取的过程中肿瘤DNA被正常细胞DNA稀释的缘故, PCR的方法也不够准确。

过表达其他EGFR配体

EGF是EGFR的天然配体, 但EGFR还有其他配体, 如表皮调节素(epiregulin)和双向蛋白(amphiregulin)。这些配体的过表达也可以促进肿瘤的生长。Khambata-Ford等^[24]在110例应用西妥昔单抗单独治疗的晚期结直肠癌患者中检测表皮调节素和双向蛋白的mRNA水平, 表皮调节素和双向蛋白mRNA水平高的患者对西妥昔单抗治疗的反应性较好, 表皮调解素mRNA水平高的患者中位PFS为103.5 d, 而表皮调解素mRNA水平低的患者中位PFS为57 d; 双向蛋白mRNA水平高的患者中位PFS为115.5 d, 而mRNA水平低的患者中位PFS为57 d。Jacobs等^[25]检测西妥昔单抗联合化疗的220例患者表皮调节素和双向蛋白的基因表达水平, K-ras野生型中高表达表皮调节素和双向蛋白的患者对治疗的反应率更高, PFS和OS也更长。K-ras野生型表皮调节素高表达患者的OS是65周, 低表达患者的OS是31周。

其他可能的生物标志物

除了上述可以预测抗EGFR单克隆抗体疗效的分子生物标志物, 其他分子生物学标志物正在研究中, 可能对预测抗EGFR单克隆抗体疗效也有意义, 如IL-8、TP53、核因子κB(nuclear factor-KappaB, NF-κB)、环氧酶-2、血管内皮细胞生长因子(vascuoar endothelial cell growth factor, VEGF)等, 但是目前对这些标志物的研究还没有定论。