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mRNA Expression of Methylase and Methyl-CpG Binding Protein in Peripheral Blood Mononuclear Cells from Patients with Generalized Pustular Psoriasis
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摘要:目的 观察泛发性脓疱型银屑病(generalized pustular psoriasis，GPP)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中DNA甲基转移酶及甲基化CpG结合蛋白(methyl-CpG binding protein，MeCP)mRNA的表达情况，初步探讨DNA甲基化在GPP中可能的作用机制。方法 回顾性收集2015年12月至2016年12月在北京协和医院皮肤科门诊或住院治疗的9例GPP患者临床资料；随机选取10例同期在医院接受健康体检的健康人做为对照，年龄和性别与GPP患者相匹配。分别留取10 ml肘正中静脉血，采用密度梯度离心法分离PBMC，应用Trizol法提取PBMC总RNA，采用实时PCR法检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD1、MBD2、MBD3、MBD4及MeCP2的mRNA表达水平，并分析年龄及病情严重程度与mRNA表达水平的相关性。结果 GPP患者PBMC中DNMT3a、DNMT3b、MBD1、MBD2、MBD4的mRNA表达水平较健康对照组升高[DNMT3a:0.000 17(0.000 06, 0.001 15)比0.000 03(0.000 02，0.000 04)；DNMT3b：0.000 04±0.000 02比0.000 02±0.000 01；MBD1：为0.001 01±0.000 45比0.000 46±0.000 15；MBD2:0.002 61±0.000 39比0.001 85±0.000 52；MBD4：0.004 29±0.001 60比0.001 57±0.000 55, P均＜0.05], 年龄及疾病严重度与上述因子mRNA的相对表达水平无相关性(P均＞0.05)。结论 GPP患者体内甲基化相关调控基因表达异常，但与年龄和疾病严重程度不相关。
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关键词:
- DNA甲基转移酶 /
- 甲基化CpG结合蛋白 /
- 泛发性脓疱型银屑病
Abstract:Objective The aim of this study was to observe the mRNA expression of DNA methyl-transferase(DNMT) and methyl-CpG binding protein(MeCP) in the peripheral blood mononuclear cells from GPP patients, and to explore the potential role of DNA methylation in the pathogenesis of GPP.Methods Clinical data of 9 GPP patients admitted or hospitalized at the Department of Dermatology of Peking Union Medical College Hospital from December 2015 to December 2016 were retrospectively collected. Ten healthy people who underwent a physical examination in the same hospital during the same period were randomly selected as the control group; their age and gender were matched with those of GPP patients. Peripheral blood mononuclear cells were isolated from 10 ml blood of the elbow median vein using density gradient centrifugation. Total RNA was extracted from peripheral blood mononuclear cells by Trizol method; mRNA expression levels of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, and MeCP2 were detected by real-time PCR. The correlation of age and GPP severity with the expression level of these mRNAs was observed and analyzed.Results Compared with the healthy subjects, the relative expressions of DNMT3a, DNMT3b, MBD1, MBD2, and MBD4 mRNA in peripheral blood mononuclear cells from GPP patients were higher than those from the healthy controls [DNMT3a:0.000 17(0.000 06, 0.001 15) vs. 0.000 03(0.000 02, 0.000 04), DNMT3b 0.000 04± 0.000 02 vs. 0.000 02±0.000 01, MBD1 0.001 01±0.000 45 vs. 0.000 46±0.000 15, MBD2 0.002 61±0.000 39 vs. 0.001 85±0.000 52; and MBD4 0.004 29±0.001 60 vs. 0.001 57±0.000 55, all P < 0.05]. There was no correlation between age and GPP severity with the mRNA expression of the above factors (all P > 0.05).Conclusions Methylation related regulatory genes are abnormally expressed in GPP patients, and do not correlate with age or the disease severity. -
1. 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性选取2015年12月至2016年12月在北京协和医院皮肤科门诊或住院治疗的9例GPP患者作为研究对象，同期在北京协和医院体检中心接受体检的10例健康人做为对照。GPP病情严重程度按Umezawa评估标准进行评分，分为轻度(0~2分)、中度(3~6分)和重度(7~10分)[12]。
1.2 入选和排除标准
GPP患者：(1)具有典型皮损并经病理确认，符合Umezawa诊断标准[12]；(2)就诊时处于脓疱发作期；(3)抽血前2个月内未使用糖皮质激素、维甲酸类、生物制剂及免疫抑制剂等药物；(4)排除红皮病型、关节型及寻常型银屑病患者；(5)无其他类型皮肤病、肿瘤、其他自身免疫病或严重疾患。
健康对照：(1)无GPP病史及银屑病家族史；(2)不伴肿瘤、其他免疫相关性皮肤病或其他严重疾病；(3)2个月内未接受其他系统性药物治疗。
本研究通过中国医学科学院北京协和医院伦理审查委员会审核批准，患者入组前均签署知情同意书。
1.3 荧光定量PCR
1.3.1 提取外周血单个核细胞
取患者和健康人肘正中静脉血10 ml，使用密度梯度离心法(3000 r/min，20 min)提取PBMC，加入1.5 ml Trizol溶液后冻存于-20 ℃冰箱。
1.3.2 引物设计
采用Roche LCPDS2软件设计基因DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD1、MBD2、MBD3、MBD4和MeCP2的引物(表 1)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
表 1 GPP患者甲基化相关调控基因引物序列基因名称 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) DNMT1 5′-GAGCTACCACGCAGACATCA-3′ CGAGGAAGTAGAAGCGGTTG DNMT3a 5′-CCGGAACATTGAGGACATCT-3′ CAGCAGATGGTGCAGTAGGA DNMT3b 5′-CCCATTCGAGTCCTGTCATT-3′ GGTTCCAACAGCAATGGACT MBD1 5′-CACCCTCTTCGACTTCAAACAAG-3′ CAACCTGACGTTTCCGAGTCTT MBD2 5′-AACCCTGCTGTTTGGCTTAAC-3′ CGTACTTGCTGTACTCGCTCTTC MBD3 5′-CCGCTCTCCTTCAGTAAATGTAAC-3′ GGCTGGAGTTTGGTTTTCAGAA MBD4 5′-TGGTGGTGCATGCCTGTAAT-3′ TGAGACAGGGTCTCTCTCTGTCAT MeCP2 5′-CCCCACCCTGCCTGAA-3′ GATGTGTCGCCTACCTTTTCG GPP:泛发性脓疱型银屑病；DNMT：DNA甲基转移酶；MBD：甲基化CpG结合域; MeCP:甲基化CpG结合蛋白 1.3.3 外周血单个核细胞总RNA提取
将上述冻存的PBMC Trizol溶液取出解冻。每1 ml冻存液中加入200 μl氯仿，剧烈震荡15 s后冰孵15 s。在4 ℃条件下以13 000 r/min离心15 min。离心后样品分3层，RNA主要在水相中。小心将RNA水相转移至新的微量离心管中，并吸取400 μl备用。加入等体积异丙醇沉淀水相中的RNA，颠倒混匀，-80 ℃过夜。次日在4 ℃条件下以13 000 r/min离心30 min，白色沉淀即为RNA。吸取上清液，剩余RNA沉淀用预冷的75%乙醇洗涤，使RNA沉淀悬浮。依旧在4 ℃条件下以1000 r/min离心10 min，弃上清。室温干燥10~15 min，加入30 ml无RNA酶水溶解沉淀，并于冰上放置1 h后放入-80 ℃冰柜冻存。
1.3.4 荧光定量PCR检测
利用LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master试剂盒(罗氏, 瑞士)在LightCycler 480 Ⅱ型荧光定量PCR仪(罗氏, 瑞士)上进行反应。反应体系：2×LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master，5 μl；10 μmol/L正向引物，0.2 μl；10 μmol/L反向引物，0.2 μl；cDNA 1 μl；无核酸酶纯水3.6 μl。PCR反应程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环(图 1)。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性：从60 ℃缓慢升温至97 ℃，每1 ℃采集5次荧光信号。将β-actin作为内参基因，使用2-△△CT法计算DNMT及MeCP的mRNA相对表达量。
1.4 统计学处理
采用SPSS 16.0统计软件，符合正态分布的mRNA相对表达量用均数±标准差表示，组间比较采用t检验；不符合正态分布的mRNA相对表达量用中位数(四分位间距)表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。采用Spearman秩相关分析年龄、疾病严重度与DNMT及MeCP mRNA表达水平的相关性。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般临床资料
9例GPP患者中女性4例，男性5例，平均年龄(33.7±1.7)岁，其中病情轻度者2例，中度3例，重度4例。10例健康对照者中女性5例，男性5例，平均年龄(31.3±1.5)岁。GPP组和健康对照组间的性别和年龄无统计学差异(P > 0.05)。
2.2 RNA质量鉴定
根据紫外分光光度仪检测结果，总RNA的OD260/OD280比值均在1.8~2.0之间，表明RNA纯度较高。用琼脂糖凝胶对RNA进行电泳，检测结果显示3条较清晰的条带，RNA纯度及完整性可满足实时PCR要求(图 2)。
2.3 荧光PCR定量结果
采用实时PCR荧光定量法检测9例GPP患者和10例健康对照者PBMC中DNMT及MeCP mRNA的表达情况(表 2)。与健康对照组相比，GPP患者PBMC中的DNMT3a、DNMT3b、MBD1、MBD2、MBD4相对表达水平显著升高(P均 < 0.05)。
表 2 GPP患者及健康人外周血单个核细胞中DNMT和MeCP mRNA相对表达量的比较基因 GPP组(n=9) 健康对照组(n=10) t/Z值 P值 DNMT1 0.001 77±0.000 76 0.001 83±0.002 00 -0.097 0.924 DNMT3a 0.000 17
(0.000 06, 0.001 15)0.000 03
(0.000 02, 0.000 04)-2.598 0.009 DNMT3b 0.000 04±0.000 02 0.000 02±0.000 01 2.326 0.021 MeCP2 0.002 08±0.000 84 0.001 79±0.000 83 0.716 0.487 MBD1 0.001 01±0.000 45 0.000 46±0.000 15 3.060 0.000 MBD2 0.002 61±0.000 39 0.001 85±0.000 52 3.284 0.005 MBD3 0.000 02±0.000 01 0.000 03±0.000 01 -1.828 0.088 MBD4 0.004 29±0.001 60 0.001 57±0.000 55 4.447 0.003 GPP、DNMT、MBD、MeCP：同表 1 2.4 GPP患者临床表型与DNMT及MeCP mRNA表达水平的相关性分析
DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD1、MBD2、MBD3、MBD4及MeCP2的mRNA表达水平与患者年龄和疾病严重程度均无相关性(P均 > 0.05，表 3)。
表 3 GPP患者年龄和疾病严重程度与DNMT及MeCP mRNA表达水平的相关分析风险因素 基因 r值 P值 年龄 DNMT1 -0.319 0.402 DNMT3a -0.067 0.864 DNMT3b -0.487 0.183 MBD1 -0.235 0.542 MBD2 -0.252 0.513 MBD3 -0.328 0.389 MBD4 -0.202 0.603 MeCP2 0.050 0.897 病情严重程度 DNMT1 -0.134 0.732 DNMT3a 0.098 0.802 DNMT3b -0.241 0.533 MBD1 -0.241 0.533 MBD2 -0.009 0.982 MBD3 -0.178 0.646 MBD4 -0.134 0.732 MeCP2 -0.285 0.457 GPP、DNMT、MBD、MeCP：同表 1 3. 讨论
本研究发现GPP患者的PBMC中，DNA甲基化相关因子的mRNA表达量发生显著变化，其中DNMT3a、DNMT3b、MBD1、MBD2和MBD4的表达显著上调，提示DNA甲基化可能在GPP中起重要作用，患者年龄及病情严重程度度与上述甲基化相关基因的表达不相关。
GPP发病机制复杂，致病原因尚不完全清楚，基因IL-36RN及CARD14在GPP的发病机制中扮演重要角色。2011年，Marrakchi团队[2]首次在突尼斯家族性GPP患者中发现了位于IL36RN基因的纯合子突变IL36RN c.80C > T(p.Leu27Pro)，并将由IL36RN基因突变产生异常IL36Ra而引起的家族性GPP命名为DITRA[2]。同年，Onoufriadis等[13]对5例无血缘关系的欧洲GPP患者进行外显子测序，发现其中3例发生IL36RN基因低频突变，2例出现c.338C > T(p.Ser113Leu)错义替代，而另1例出现c.338C > T(p.Ser113Leu)及c.142C > T(p.Arg48Trp)错义替代的复合突变，首次将DITRA概念从家族性GPP扩展至散发性GPP。2012年，Jordan等[3]首次发现CARD14基因与GPP发病相关，并报告了1例海地GPP患儿携带新生胚系杂合突变c.413A > C(p.Glu138Ala)。继而Korber等[5]在欧洲GPP患者中发现了源自CARD14的p.Arg69Gln、p.Gly117Ser、p.Ser200Asn和p.Arg826Trp突变，并证实这些突变导致的CARD14功能缺陷可能是GPP发病的重要遗传因素。2014年在19例与寻常型银屑病相关的GPP中发现2例(21.1%)患者携带CARD14基因p.Asp176His突变，携带率较对照组(3%)升高[14]。易感基因遗传方式虽然可以解释部分GPP的发病，但无法全面揭示性别、年龄及诱因对疾病发生发展的影响，无法回答感染、妊娠和特殊药物应用等状态诱发GPP发生的机制。
DNA甲基化是正常胚胎发育的重要过程，具有多种功能，参与基因表达调控、染色质修饰、细胞分化和发展以及X染色体失活等过程[9]。DNA甲基化主要发生在CpG 5-胞嘧啶上，启动子区CpG岛通常处于非甲基化状态，基因正常表达。当CpG岛的甲基化状态发生异常改变后，影响基因的转录调控，使得基因处于沉默或过度表达状态[9]。DNA甲基化的过程主要受DNMT催化完成甲基化过程[9]。DNA甲基化的修饰状态受一定条件影响，且随年龄变化发生改变。目前认为DNMT包括DNMT1、DNMT3a、DNMT3b。DNMT1可能与酶的活性、DNA结合调节有关，作用在于维持DNA的甲基化并将这种甲基化稳定传递给子代。DNMT3a和DNMT3b是人体主要的甲基化转移酶[15]。本研究显示DNMT1在GPP患者中的表达较健康组略微下调，而DNMT3a、DNMT3b显著上调，提示GPP患者体内存在DNMT状态异常导致的DNA基因组异常甲基化模式，DNMT1水平下调可能诱导炎症免疫相关基因甲基化水平下调，使得部分炎症免疫通路过度激活，诱发疾病，而DNMT3a及DNMT3b上调则可能使GPP患者某些炎症抑制基因如PDCD1沉默，使得其抑制炎症能力降低，从而诱发GPP发生。
具有相同MBD的5种蛋白(MBD1、MBD2、MBD3、MBD4、MeCP2)通过识别甲基化DNA参与转录抑制，被称为MBD家族[16]。MBD的存在方式为单体，其与其他蛋白质或复合物结合的方式可能并不稳定。MeCP2在体内外均可以抑制启动子区域的甲基化基因转录，但对非甲基化启动子并无作用，可以通过转录抑制区域和关键转录因子的相互作用抑制转录过程[17]。MBD1的相对分子质量在家族中最大，可以与染色质相关因子形成复合物，结合在启动子区SP1位点抑制转录。MBD2蛋白参与启动子区高甲基化的基因沉默，当高甲基化的启动子未与MBD2结合后，基因表达增加。MBD2可能具有去甲基化酶的作用，通过与组蛋白乙酰基转移酶基及TACC3蛋白形成复合物，使得启动子区域的甲基化沉默基因恢复活性。由此可知，MBD2的功能不仅可以介导转录沉默，还可以在甲基化启动子区域通过与其他蛋白质互相作用，在不改变甲基化状态的情况下，通过改变染色质的构想激活基因。MBD3与MBD2高度相似，MBD2可以与MBD3结合成异二聚体，进一步强化染色质的抑制状态。此外MBD3蛋白的MBD可与DNMT3a的N末端相互作用。MBD4是唯一具有其他功能的MBD蛋白，其C末端具有DNA修复酶活性，因此也属于DNA修复系统，可以识别CpG位点错配的T或U并给予修正。MBD4是参与启动子区域高甲基化状态的重要因子，同时其修复活性对于维持启动子区域高甲基化状态也是必需的[18]。
DNA甲基化的过程十分复杂，多种相关蛋白因子相互作用。本研究提示GPP患者可能在不同甲基化催化因子的作用下发生不同基因的高甲基化及低甲基化状态，从而导致基因的低表达及过表达，激活相关炎症通路，同时也说明GPP DNA甲基化水平的变化过程十分复杂，甲基化的诱发、催化、维持乃至去甲基化过程由一系列的蛋白家族及调节因子相互作用而成，而DNA甲基化的差异过程又同GPP的发生紧密联系。本研究同时发现，患者的发病年龄及病情严重程度与甲基化相关基因的表达无明显相关，提示甲基化虽然可能导致GPP的发生，但可能与其临床表现并无联系。
本研究为回顾性，标本量较少，临床资料(如病情严重程度等)的收集可能存在一定偏倚, 未来需大样本试验进一步验证。
随着研究的深入，DNA甲基化调控的复杂机制终将逐渐清晰，针对甲基化过程中不同因子表达水平的检测及相应生物制剂的研究或许可为GPP的诊断和治疗提供新的思路。
志谢: 衷心感谢参与本项研究的GPP患者及全体工作人员。利益冲突 无 -
表 1 GPP患者甲基化相关调控基因引物序列
基因名称 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) DNMT1 5′-GAGCTACCACGCAGACATCA-3′ CGAGGAAGTAGAAGCGGTTG DNMT3a 5′-CCGGAACATTGAGGACATCT-3′ CAGCAGATGGTGCAGTAGGA DNMT3b 5′-CCCATTCGAGTCCTGTCATT-3′ GGTTCCAACAGCAATGGACT MBD1 5′-CACCCTCTTCGACTTCAAACAAG-3′ CAACCTGACGTTTCCGAGTCTT MBD2 5′-AACCCTGCTGTTTGGCTTAAC-3′ CGTACTTGCTGTACTCGCTCTTC MBD3 5′-CCGCTCTCCTTCAGTAAATGTAAC-3′ GGCTGGAGTTTGGTTTTCAGAA MBD4 5′-TGGTGGTGCATGCCTGTAAT-3′ TGAGACAGGGTCTCTCTCTGTCAT MeCP2 5′-CCCCACCCTGCCTGAA-3′ GATGTGTCGCCTACCTTTTCG GPP:泛发性脓疱型银屑病；DNMT：DNA甲基转移酶；MBD：甲基化CpG结合域; MeCP:甲基化CpG结合蛋白 
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表 2 GPP患者及健康人外周血单个核细胞中DNMT和MeCP mRNA相对表达量的比较
基因 GPP组(n=9) 健康对照组(n=10) t/Z值 P值 DNMT1 0.001 77±0.000 76 0.001 83±0.002 00 -0.097 0.924 DNMT3a 0.000 17
(0.000 06, 0.001 15)0.000 03
(0.000 02, 0.000 04)-2.598 0.009 DNMT3b 0.000 04±0.000 02 0.000 02±0.000 01 2.326 0.021 MeCP2 0.002 08±0.000 84 0.001 79±0.000 83 0.716 0.487 MBD1 0.001 01±0.000 45 0.000 46±0.000 15 3.060 0.000 MBD2 0.002 61±0.000 39 0.001 85±0.000 52 3.284 0.005 MBD3 0.000 02±0.000 01 0.000 03±0.000 01 -1.828 0.088 MBD4 0.004 29±0.001 60 0.001 57±0.000 55 4.447 0.003 GPP、DNMT、MBD、MeCP：同表 1
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表 3 GPP患者年龄和疾病严重程度与DNMT及MeCP mRNA表达水平的相关分析
风险因素 基因 r值 P值 年龄 DNMT1 -0.319 0.402 DNMT3a -0.067 0.864 DNMT3b -0.487 0.183 MBD1 -0.235 0.542 MBD2 -0.252 0.513 MBD3 -0.328 0.389 MBD4 -0.202 0.603 MeCP2 0.050 0.897 病情严重程度 DNMT1 -0.134 0.732 DNMT3a 0.098 0.802 DNMT3b -0.241 0.533 MBD1 -0.241 0.533 MBD2 -0.009 0.982 MBD3 -0.178 0.646 MBD4 -0.134 0.732 MeCP2 -0.285 0.457 GPP、DNMT、MBD、MeCP：同表 1
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