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Evaluation of Influence Factors in the Identification of Clinical Filamentous Fungi by Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-time of Flight Mass Spectrometry
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摘要:目的 评估菌株培养条件、培养天数以及结果判定截断值(cut-off value, COV) 3种因素对基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)鉴定丝状真菌能力的影响。方法 将78株受试丝状真菌分别接种到沙堡弱葡萄糖琼脂(sabouraud dextrose agar, SDA)、土豆葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)两种培养基及28、35℃两种培养温度共4种组合的培养条件下进行培养, 并于培养第2、3、4、5天以及第7天对其进行MALDI-TOF MS分析, 根据鉴定率的差异筛选菌株MALDI-TOF MS鉴定用最佳培养条件和培养天数; 下调MALDI-TOF MS结果判定COV, 分析其对MALDI-TOF MS丝状真菌鉴定率的影响。结果 受试菌株在SDA和PDA两种培养基间的MALDI-TOF MS鉴定率无显著性差异(χ2=0.467, P=0.792), 但28℃培养温度下的鉴定率高于35℃培养温度(χ2=7.195, P=0.027);培养第2、3天种水平(40.3%和34.3%)和属水平(44.8%和46.3%)鉴定率均较高; 将MALDI-TOF MS种水平判定COV由 > 2.0下调至 > 1.7后, 受试菌株种水平判定率显著提升(85.9%比32.1%, χ2=40.119, P < 0.01)且不增加错误鉴定率。结论 丝状真菌以SDA或PDA培养基28℃培养2~3 d, 并以分值> 1.7作为种水平判定COV, 可有效提高MALDI-TOF MS对丝状真菌的鉴定能力。
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关键词:
- 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 /
- 丝状真菌 /
- 鉴定 /
- 影响因素
Abstract:Objective This study aimed to evaluate the potential influence of culture conditions, incubation time, and the interpreting cut-off value(COV) in the identification of filamentous fungi by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS).Methods Seventy-eight isolates of filamentous fungi were cultivated in sabouraud dextrose agar(SDA) or potato dextrose agar(PDA) media with an incubation temperature of 28℃ or 35℃ separately, namely four different culture conditions.MALDI-TOF MS identification was carried out at different time including the 2nd, 3rd, 4th, 5th and 7th days of incubation of the isolates. Differences in identification capacities of MALDI-TOF MS under the tested parameters were analyzed to determine the optimal culture condition and incubation time of filamentous fungi. The influence of lowered interpreting COV in MALDI-TOF MS identification of filamentous fungi was also evaluated.Results No significant difference was detected between the SDA and PDA culture media in the identification capacities of MALDI-TOF MS(χ2=0.467, P=0.792). The identification capacity of MALDI-TOF MS with the incubation temperature of 28℃ was superior to that of 35℃(χ2=7.195, P=0.027). Higher identification rates of species level(40.3%, 34.3%) and genus level(44.8%, 46.3%) were achieved in isolates incubated for 2 and 3 days. The identification rate of species level was increased significantly from 32.1% to 85.9%(χ2=40.119, P < 0.01) without increasing the false identification rate after adjusting the interpreting COV from score > 2.0 to > 1.7.Conclusion The performance of MALDI-TOF MS in the identification of filamentous fungi could be improved by applying the optimal culture condition of incubating in SDA or PDA media under the temperature of 28℃ for 2 to 3 days and by adjusting the interpreting COV of the species level with a score > 1.7. -
胃癌是常见的消化系统肿瘤，在全世界最常见的恶性肿瘤中位居第4位，且位居癌症死因的第2位[1]。早期胃癌(early gastric cancer, EGC)是指癌组织局限于胃黏膜层或黏膜下层，无论有无淋巴结转移。低级别上皮内瘤变(low-grade gastric intraepithelial neoplasia, LGIN)、高级别上皮内瘤变(high-grade gastric intraepithelial neoplasia，HGIN)是公认的癌前病变。进展期胃癌(advanced gastric cancer, AGC)的5年生存率不足20%，而EGC手术治疗预后良好，术后5年生存率可达90%以上[2-3]。由于EGC缺乏明显的临床症状，诊断率低，因此寻找相关分子标志物对EGC患者具有重要意义。
菱形结构域蛋白(rhomboid domain-containing protein 1, RHBDD1)是2008年我国学者进行生精细胞基因差异表达筛选时发现的丝氨酸蛋白酶Rhomboid家族新成员[4]。前期研究结果已证明RHBDD1蛋白质具有膜内丝氨酸蛋白酶活性，能够通过切割底物包括促凋亡蛋白BIK、肿瘤抑制子活化通路蛋白TSAP6等发挥重要的生物学作用[5]。近期研究还发现RHBDD1与肿瘤发生密切相关，在结直肠癌和乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达[6-7]。但目前尚无RHBDD1与胃癌之间关系的报道，本研究在慢性浅表性胃炎(chronic superficial gastritis, CSG)、胃癌前病变、EGC和AGC患者的胃黏膜组织中检测RHBDD1的表达，研究RHBDD1与胃癌发生发展的关系，并探究其是否有助于胃部疾病的良恶性鉴别诊断。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性收集2015年1月至2018年1月北京医院消化内科收治的胃部术后患者临床资料，包括手术治疗方式、病理诊断等，由两名病理科医生结合组织蜡块HE染色切片对病变组织病理学诊断结果重新进行独立判读。
纳入标准：(1)年龄≥18岁；(2)完成内镜黏膜下剥离术(endoscopic submucosal dissection，ESD)治疗或在普通外科接受手术治疗；(3)依据世界卫生组织消化系统肿瘤分类(2010版)[1]，术后病理明确诊断为胃癌、癌前病变或慢性浅表性胃炎，不论淋巴结转移与否，病变局限于黏膜层及黏膜下层定义为EGC，浸润超过黏膜下层为AGC。
排除标准：(1)病理资料不完整；(2)判读结果不一致；(3)伴发系统肿瘤疾病或癌前病变。
本研究已通过北京医院伦理委员会批准(审批号：2017BJYYEC-085-01)。
1.2 样本量计算
本研究前期收集北京医院消化内科收治的胃癌以及慢性浅表性胃炎16例患者临床资料，对病变的组织病理学诊断结果进行重新判读。初步得到RHBDD1免疫组化得分对诊断胃癌的灵敏度(Sen)为82%，特异度(Spe)为75%，以显著性水平α=0.05, 允许误差δ=10%计算样本量，使用公式：
$$ {n_1} = {\rm{Z}}2 * {\rm{Sen}} * 1 - {\rm{Sen}}/\delta 2{\rm{ = }}57 $$ $${n_2} = {\rm{Z}}2 * {\rm{Sen}} * 1 - {\rm{Sen}}/\delta 2{\rm{ = }}72 $$ n1 < n2，故以72为期望样本量，考虑到试验过程中样本损耗应适当增加纳入人数。
1.3 胃黏膜组织免疫组化染色及判读标准
ESD或手术切除胃组织放入中性甲醛溶液固定，每隔2 mm取材，经水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋后制成蜡块，切成3 μm的薄片。经过抗体染核，脱水，封片后在光学显微镜下观察切片，RHBDD1阳性着色于细胞质中，为棕黄色颗粒。免疫组化结果由两名病理科医生在光学显微镜下进行判读，随机选取5个高倍镜视野，得分取平均值计数。结果判读评价标准：(1)染色强度：即阳性染色细胞的平均强度，阴性=0，弱阳性=1，中等强度阳性=2，强阳性=3(图 1)；(2)阳性细胞百分比：即阳性染色的细胞数占视野内所有细胞的估计百分比， < 10% =0，10%~ 34%=1，35%~59%=2，60%~85%=3；(3)RHBDD1免疫组化结果=染色强度得分+阳性细胞百分比得分(范围：0~6分)，RHBDD1＜2分判为阴性，≥2分判为阳性[8]。二抗名称：兔超敏二步法(货号：PV-9001)、鼠超敏二步法(货号：PV-9002)，均购自北京中杉金桥生物技术公司。
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图 1 RHBDD1在不同胃黏膜病变中的免疫组化染色强度A.慢性浅表性胃炎, RHBDD1表达呈阴性；B.低级别上皮内瘤变, RHBDD1表达呈弱阳性；C.高级别上皮内瘤变, RHBDD1表达呈中等强度阳性；D.早期胃癌, RHBDD1表达呈强阳性RHBDD1:菱形结构域蛋白1.4 统计学处理
应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，所有计量资料先通过Q-Q图和P-P图判断是否服从正态分布；正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析或t检验；偏态分布的计量资料以中位数(四分位数)表示，组间比较采用非参数检验(Kruskal-Wallis检验)。计数资料以频数或百分数表示，组间比较采用卡方检验、趋势卡方检验(线性和线性组合)。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般临床资料
共76例符合纳入和排除标准的患者入选本研究，其中男性45例，女性31例，平均年龄(57.3±9.7)岁。共包含152处病变，其中CSG 17处，LGIN 21处、HGIN 54处、EGC 44处、AGC 16处(图 2)。
2.2 胃黏膜组织免疫组化结果
在152处胃黏膜组织中，RHBDD1表达阴性者占27.6%(42/152)，阳性者占72.4%(110/152)。其中，CSG黏膜组织RHBDD1阳性表达占35.3%(6/17)，LGIN黏膜组织RHBDD1阳性表达占71.4%(15/21)，HGIN黏膜组织RHBDD1阳性表达占77.8%(42/54)，EGC黏膜组织RHBDD1阳性表达占75.0%(33/44)，AGC黏膜组织RHBDD1阳性表达占87.5%(14/16)，CSG黏膜组织中RHBDD1的表达显著低于非CSG(LGIN、HGIN、EGC和AGC)，差异具有统计学意义(χ2=13.157，P=0.001，表 1)；LGIN(χ2=1.384，P=0.423)、HGIN(χ2=0.729，P=0.497)、EGC(χ2=1.080，P=0.481)组织中RHBDD1的表达均低于AGC，但差异无统计学意义。病变轻重程度与RHBDD1免疫组化得分之间的趋势卡方检验结果显示，线性和线性组合的值为9.049，P=0.003。
表 1 152处不同胃黏膜病变组织中RHBDD1表达水平[n(%)]病变类型 RHBDD1阴性
(n=42)RHBDD1阳性
(n=110)χ2值 P值 CSG(n=17) 11(64.7) 6(35.3) 13.157 0.001* 非CSG(n=135) 31(23.0) 104(77.0) LGIN(n=21) 6(28.6) 15(71.4) HGIN(n=54) 12(22.2) 42(77.8) EGC(n=44) 11(25.0) 33(75.0) AGC(n=16) 2(12.5) 14(87.5) CSG：慢性浅表性胃炎；LGIN：胃低级别上皮内瘤变；HGIN：胃高级别上皮内瘤变；EGC：早期胃癌；AGC：进展期胃癌；*CSG与非CSG(LGIN、HGIN、EGC和AGC)相比，P=0.001 3. 讨论
本研究结果显示，CSG组织中RHBDD1的表达显著低于非CSG病变(LGIN、HGIN、EGC和AGC)，差异具有统计学意义(P=0.001)。胃黏膜病变RHBDD1表达的阳性率随病变严重程度逐渐升高。
恶性肿瘤的发生, 常常与维持机体细胞正常生长、分化过程的基因异常调控有关[9]。RHBDD1是Rhomboid蛋白家族成员之一，是一种6次跨膜的膜内丝氨酸蛋白酶。RHBDD1能切割转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)前体并释放活性配体，从而增强表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)信号通路，刺激肿瘤生长[6]。
病理学上，胃癌为腺癌，且肠型胃癌是由CSG、肠上皮化生、LGIN、HGIN逐步进展而来，而这一系列过程的发生、发展与基因突变、染色体和微卫星不稳定、表观遗传变化、幽门螺杆菌感染、饮食及慢性炎症等因素密切相关[12-13]。本研究在不同阶段的胃黏膜组织中检测RHBDD1表达水平，发现胃癌前病变、EGC及AGC组织中的表达水平显著高于CSG组织(P=0.001)，RHBDD1的着色强度在HGIN及EGC中呈强阳性，而在AGC中呈中度阳性，提示RHBDD1基因可能参与了胃黏膜的恶性转化过程。
RHBDD1作为近期新发现的参与细胞生长的蛋白，有研究显示其在结直肠癌组织、乳腺癌组织中含量均高于正常组织[6-7]，与结直肠癌、乳腺癌的发生关系密切，另一方面，其还能抑制细胞凋亡并促进肿瘤转移[8, 11]。本研究发现，在CSG癌变过程中，胃黏膜病变RHBDD1表达的阳性率总体趋势是逐渐升高的[CSG(35.3%)→癌前病变(LGIN+HGIN)(74.7%)→EGC(75.0%)→AGC(87.5%)]，推测可能与其促进炎症反应和细胞增殖有关。细胞学研究显示，RHBDD1可能通过激活EGFR信号通路以刺激肿瘤的生长[6, 14]，并能促进结直肠癌的转移[11]。最新一项研究显示，RHBDD1在大肠癌细胞和组织中是miR-145-5p的靶点，miR-145-5p通过下调RHBDD1和EGFR相关信号抑制大肠癌的发生[18]。人表皮生长因子受体2属于EGFR家族成员之一，在胃癌组织中高表达[15]，并与转移有关[16]。RHBDD1是否也是通过EGFR信号通路参与胃癌发生发展，能否成为治疗胃癌的靶点之一，仍需进一步研究寻找依据。
胃黏膜组织的两两比较发现，HGIN和EGC的RHBDD1阳性表达率较为接近，且HGIN阳性表达率略高于EGC。RHBDD1作为Rhomboid家族蛋白酶成员之一，该家族是受控膜内蛋白水解蛋白酶家族中一类从细菌到人类均极度保守且功能重要的丝氨酸蛋白酶，已被证明可以调节生长因子信号、线粒体动力学、炎症、寄生虫入侵和蛋白质质量控制[10]。在CSG持续活动并向癌前病变转化的过程中，RHBDD1可以导致细胞增殖、侵袭、迁移能力增加，还可减少肿瘤细胞的凋亡。而胃黏膜癌变过程受多种因素调控，相比于EGC，HGIN阶段的炎症和生长状态可能更为复杂和活跃，推测RHBDD1可能在胃炎向胃癌发展过程中的某个阶段发挥一定作用。
本研究仍存在一定局限：免疫组化是半定量的研究方法，虽然本次研究采用了双人双盲的评分方法，但仍受主观影响，不能避免测量偏倚。
本研究对胃癌、癌前病变及CSG病变组织中的RHBDD1表达水平进行比较，发现RHBDD1的表达阳性率在LGIN、HGIN、EGC、AGC的组织中明显高于CSG，尤其是HGIN和EGC的着色强度显著增高，提示RHBDD1在胃癌的恶性程度转化过程中发挥一定作用，但其作用机制仍需进一步的分子生物学研究。结合病变的组织病理学特点，RHBDD1免疫组化染色可能有助于胃癌前病变、EGC和AGC的临床诊断和治疗。
利益冲突 无 -
表 1 菌株培养条件对MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌能力的影响[n(%)]
菌种 株数 SDA PDA 28 ℃ 35 ℃ 28 ℃ 35 ℃ 种水平 属水平 无法鉴定 种水平 属水平 无法鉴定 种水平 属水平 无法鉴定 种水平 属水平 无法鉴定 曲霉 67 21(31.3) 31(42.3) 15(22.4) 15(22.4) 32(47.8) 20(29.8) 19(28.4) 34(50.7) 14(20.9) 14(20.9) 34(50.7) 19(28.4) 烟曲霉 39 7 23 9 6 21 12 9 21 9 4 23 12 黄曲霉 13 7 4 2 5 5 3 5 7 1 6 5 2 黑曲霉 7 3 1 3 2 2 3 2 3 2 1 3 3 土曲霉 4 1 2 1 0 2 2 1 1 2 1 1 2 构巢曲霉 3 3 0 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 杂色曲霉 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 镰刀菌 7 1(14.3) 4(57.1) 2(28.6) 0(0) 2(28.6) 5(71.4) 1(14.3) 5(71.4) 1(14.3) 0(0) 2(28.6) 5(71.4) 茄病镰刀菌 3 1 1 1 0 1 2 1 2 0 0 1 2 串珠镰刀菌 3 0 2 1 0 1 2 0 2 1 0 0 3 层生镰刀菌 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 接合菌 4 0(0) 2(50.0) 2(50.0) 0(0) 0(0) 4(100) 0(0) 1(25.0) 3(75.0) 0(0) 1(25.0) 3(75.0) 小孢根霉 2 0 1 1 0 0 2 0 0 2 0 0 2 卷枝毛霉 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 总状共头霉 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 总计 78 22(28.2) 37(47.4) 19(24.4) 15(19.3) 34(43.6) 29(37.2) 20(25.6) 40(51.3) 18(23.1) 14(17.9) 37(47.4) 27(34.6) MALDI-TOF MS：同图 1；SDA:沙堡弱葡萄糖琼脂；PDA:土豆葡萄糖琼脂 
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表 2 培养天数对MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌能力的影响[n(%)]
菌种 株数 第2天 第3天 第4天 第5天 第7天 种水平 属水平 种水平 属水平 种水平 属水平 种水平 属水平 种水平 属水平 曲霉 67 27(40.3) 30(44.8) 23(34.3) 31(46.3) 9(13.4) 30(44.8) 3(4.5) 21(31.3) 0(0) 8(11.9) 烟曲霉 39 12 21 10 21 5 15 0 11 0 2 黄曲霉 13 6 5 6 4 2 5 1 5 0 3 黑曲霉 7 4 2 3 3 0 5 0 2 0 0 土曲霉 4 1 2 0 3 0 3 0 1 0 0 构巢曲霉 3 3 0 3 0 2 1 2 1 0 3 杂色曲霉 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 镰刀菌 7 3(42.9) 4(57.1) 2(28.6) 5(71.4) 1(14.3) 4(57.1) 0(0) 4(57.1) 0(0) 3(42.9) 茄病镰刀菌 3 2 1 1 2 0 2 0 2 0 1 串珠镰刀菌 3 1 2 1 2 1 1 0 2 0 2 层生镰刀菌 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 接合菌 4 0(0) 4(100) 0(0) 4(100) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 小孢根霉 2 0 2 0 2 0 0 0 0 0 0 卷枝毛霉 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 总状共头霉 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 总计 78 30(38.5) 38(48.7) 25(32.1) 40(51.8) 10(12.8) 34(43.6) 3(3.8) 25(32.1) 0(0) 11(14.1) MALDI-TOF MS：同图 1
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表 3 结果判定截断值对MALDI-TOF MS丝状真菌鉴定能力的影响[n(%)]
菌种 株数 Bruker推荐截断值 调整后截断值 种水平(＞2.0) 属水平(1.7~2.0) 种水平(＞1.7) 属水平(1.4~1.7) 曲霉属 67 23(34.3) 33(49.3) 56(83.6) 9(13.4) 烟曲霉 39 10 23 33 5 黄曲霉 13 6# 4 10* 3 黑曲霉 7 3 3 6 0 土曲霉 4 0 3 3 1 构巢曲霉 3 3 0 3 0 杂色曲霉 1 1 0 1 0 镰刀菌 7 2(28.6) 5(71.4) 7(100) 0(0) 茄病镰刀菌 3 1 2 3 0 串珠镰刀菌 3 1# 2 3# 0 层生镰刀菌 1 0 1 1# 0 接合菌 4 0(0) 4(100) 4(100) 0(0) 小孢根霉 2 0 2 2 0 卷枝毛霉 1 0 1 1# 0 总状共头霉 1 0 1 1 0 总计 78 25(32.1) 42(53.8) 67(85.9) 9(11.5) *其中2株黄曲霉被错误鉴定为米曲霉；#其中1株黄曲霉被错误鉴定为米曲霉，1株串珠镰刀菌被错误鉴定为茄病镰刀菌，1株层生镰刀菌被错误鉴定为串珠镰刀菌，1株卷枝毛霉被错误鉴定为多分枝毛霉
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百度学术
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