邮件订阅 RSS

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定丝状真菌的影响因素分析

李颖, 张戈, 杨洋, 李冬雪, 王贺, 徐英春

李颖, 张戈, 杨洋, 李冬雪, 王贺, 徐英春. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定丝状真菌的影响因素分析[J]. 协和医学杂志, 2020, 11(2): 156-161. DOI: 10.3969/j.issn.1674-9081.20170245
引用本文: 李颖, 张戈, 杨洋, 李冬雪, 王贺, 徐英春. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定丝状真菌的影响因素分析[J]. 协和医学杂志, 2020, 11(2): 156-161. DOI: 10.3969/j.issn.1674-9081.20170245
shu
Ying LI, Ge ZHANG, Yang YANG, Dong-xue LI, He WANG, Ying-chun XU. Evaluation of Influence Factors in the Identification of Clinical Filamentous Fungi by Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-time of Flight Mass Spectrometry[J]. Medical Journal of Peking Union Medical College Hospital, 2020, 11(2): 156-161. DOI: 10.3969/j.issn.1674-9081.20170245
Citation: Ying LI, Ge ZHANG, Yang YANG, Dong-xue LI, He WANG, Ying-chun XU. Evaluation of Influence Factors in the Identification of Clinical Filamentous Fungi by Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-time of Flight Mass Spectrometry[J]. Medical Journal of Peking Union Medical College Hospital, 2020, 11(2): 156-161. DOI: 10.3969/j.issn.1674-9081.20170245
shu

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定丝状真菌的影响因素分析

  • 1.

    中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 检验科 北京市重点实验室, 北京 100730

  • 2.

    中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 侵袭性真菌病精准诊断与机制研究 北京市重点实验室, 北京 100730

详细信息
    通讯作者:

    徐英春 电话:010-69159766, E-mail:xycpumch@139.com

  • 中图分类号: R446.5

Evaluation of Influence Factors in the Identification of Clinical Filamentous Fungi by Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-time of Flight Mass Spectrometry

  • 1.

    Department of Clinical Laboratory, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100730, China

  • 2.

    Beijing Key Laboratory for Mechanisms Research and Precision Diagnosis of Invasive Fungal Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100730, China

More Information
    Corresponding author:

    Ying-chun XU: XU Ying-chun Tel: 86-10-69159766, E-mail: xycpumch@139.com

HTML全文

    摘要
  • 摘要:
      目的  评估菌株培养条件、培养天数以及结果判定截断值(cut-off value, COV) 3种因素对基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)鉴定丝状真菌能力的影响。
      方法  将78株受试丝状真菌分别接种到沙堡弱葡萄糖琼脂(sabouraud dextrose agar, SDA)、土豆葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)两种培养基及28、35℃两种培养温度共4种组合的培养条件下进行培养, 并于培养第2、3、4、5天以及第7天对其进行MALDI-TOF MS分析, 根据鉴定率的差异筛选菌株MALDI-TOF MS鉴定用最佳培养条件和培养天数; 下调MALDI-TOF MS结果判定COV, 分析其对MALDI-TOF MS丝状真菌鉴定率的影响。
      结果  受试菌株在SDA和PDA两种培养基间的MALDI-TOF MS鉴定率无显著性差异(χ2=0.467, P=0.792), 但28℃培养温度下的鉴定率高于35℃培养温度(χ2=7.195, P=0.027);培养第2、3天种水平(40.3%和34.3%)和属水平(44.8%和46.3%)鉴定率均较高; 将MALDI-TOF MS种水平判定COV由 > 2.0下调至 > 1.7后, 受试菌株种水平判定率显著提升(85.9%比32.1%, χ2=40.119, P < 0.01)且不增加错误鉴定率。
      结论  丝状真菌以SDA或PDA培养基28℃培养2~3 d, 并以分值> 1.7作为种水平判定COV, 可有效提高MALDI-TOF MS对丝状真菌的鉴定能力。
    Abstract:
      Objective  This study aimed to evaluate the potential influence of culture conditions, incubation time, and the interpreting cut-off value(COV) in the identification of filamentous fungi by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS).
      Methods  Seventy-eight isolates of filamentous fungi were cultivated in sabouraud dextrose agar(SDA) or potato dextrose agar(PDA) media with an incubation temperature of 28℃ or 35℃ separately, namely four different culture conditions.MALDI-TOF MS identification was carried out at different time including the 2nd, 3rd, 4th, 5th and 7th days of incubation of the isolates. Differences in identification capacities of MALDI-TOF MS under the tested parameters were analyzed to determine the optimal culture condition and incubation time of filamentous fungi. The influence of lowered interpreting COV in MALDI-TOF MS identification of filamentous fungi was also evaluated.
      Results  No significant difference was detected between the SDA and PDA culture media in the identification capacities of MALDI-TOF MS(χ2=0.467, P=0.792). The identification capacity of MALDI-TOF MS with the incubation temperature of 28℃ was superior to that of 35℃(χ2=7.195, P=0.027). Higher identification rates of species level(40.3%, 34.3%) and genus level(44.8%, 46.3%) were achieved in isolates incubated for 2 and 3 days. The identification rate of species level was increased significantly from 32.1% to 85.9%(χ2=40.119, P < 0.01) without increasing the false identification rate after adjusting the interpreting COV from score > 2.0 to > 1.7.
      Conclusion  The performance of MALDI-TOF MS in the identification of filamentous fungi could be improved by applying the optimal culture condition of incubating in SDA or PDA media under the temperature of 28℃ for 2 to 3 days and by adjusting the interpreting COV of the species level with a score > 1.7.
    • HTML全文

  • 近年来，随着自身免疫病、艾滋病、肿瘤等恶性疾病患病率的不断攀升，曲霉等丝状真菌的临床感染率也在逐年升高[1-3]。丝状真菌种类繁多，不同菌种间耐药谱存在一定差异，如曲霉属中的土曲霉和构巢曲霉对抗真菌药两性霉素B天然耐药，焦曲霉和迟缓曲霉对两性霉素B及唑类药物灵敏度低；镰刀菌和接合菌对唑类及棘白菌素抗真菌药多不敏感[4-7]。因此，对丝状真菌分离株进行准确种属鉴定对于指导临床用药具有重要意义。尽管现阶段形态学方丰富的真菌鉴定经验。基因序列分析技术在微生物菌种鉴定方面具有较高的准确度，但费用、对操作人员及操作环境要求均较高，一定程度上限制了其在微生物实验室的常规开展与应用。

    基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是新兴的微生物快速鉴定分析技术，检测成分主要为微生物胞内核糖体蛋白，经系统处理后得到与蛋白成分对应的质谱峰图，然后与数据库内包含菌株的参考质谱峰图进行比对，根据谱图相似程度对微生物进行菌种鉴定，现已成功应用于细菌及酵母菌菌种的鉴定且成效显著[8-9]；MALDI-TOF MS也可用于曲霉等丝状真菌菌种鉴定，但其鉴定能力略逊，主要是由于曲霉等丝状真菌本身的复杂性以及现有数据库内丝状真菌菌种涵盖范围有限；另一方面，不同研究在受试菌株的培养条件、MALDI-TOF MS鉴定结果判定标准即截断值(cut-off value, COV)以及所选用的数据库等方面存在差别，致使其鉴定能力在不同研究中差异较大[10-12]。本研究拟对Bruker MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌过程中涉及的灵活环节，即菌株的培养条件、培养时间以及结果判定COV进行评估，旨在优化Bruker MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌的流程，提高整体鉴定能力。

    1.   材料与方法

    1.1   菌株

    收集北京协和医院2016年10月至12月分离自临床患者送检标本的丝状真菌共计78株。全部菌株均经内转录间隔区以及钙调蛋白基因或转录延长因子1α基因序列分析实现准确种属鉴定[13-14]，其中曲霉67株、镰刀菌7株、接合菌4株。

    1.2   主要仪器与试剂

    Bruker AutoflexTM LT MALDI-TOF MS系统及丝状真菌数据库(Filamentous fungi library v1.0)均购自德国布鲁克公司。真菌用沙堡弱葡萄糖琼脂(sabouraud dextrose agar, SDA)和土豆葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基购自英国OXOID公司，甲酸溶液购自法国Sigma公司，乙腈溶液购自比利时ACROS公司，α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid, HCCA)基质液购自德国布鲁克公司。

    1.3   具体操作

    1.3.1   菌株培养条件优化

    将受试菌株以3点式方式接种于常用真菌培养基SDA和PDA各2个，分别放置于28 ℃真菌培养箱和35 ℃普通培养箱中进行培养，即SDA 28 ℃、SDA 35 ℃、PDA 28 ℃、PDA 35 ℃共4种培养条件。同一时段对上述4种培养条件下生长的菌落进行MALDI-TOF MS鉴定，根据鉴定率差异筛选丝状真菌MALDI-TOF MS鉴定用最佳培养条件。

    1.3.2   培养天数优化

    在确定受试菌株MALDI-TOF MS鉴定用最佳培养条件后，对该条件下培养第2、3、4、5天以及第7天的菌落分别进行MALDI-TOF MS鉴定，比较不同培养天数在丝状真菌MALDI-TOF MS鉴定率上的差异，筛选最佳培养天数。

    1.3.3   MALDI-TOF MS鉴定

    采用标准甲酸-乙腈提取法对受试菌株进行分析前处理，具体步骤为：生物安全柜内无菌接种环刮取目的菌落外围较新鲜菌丝成分适量至300 μl灭菌水中(图 1)，加入900 μl无水乙醇，混匀，静置5 min；室温条件下12 000 rpm离心3 min，弃上清；50~80 μl 70%甲酸溶液重悬菌体沉淀，室温放置5~10 min，以利于甲酸充分发挥破壁作用；然后加入等量乙腈溶液，混匀，室温放置5~10 min。短暂离心后吸取1 μl离心上清点样于Bruker MSP 384靶板，干燥后覆盖1 μl HCCA基质液；完全干燥后放入Bruker AutoflexTM LT MALDI-TOF MS仪器机舱进行检测，检测参数参照Bruker用户手册，分析数据库选用Bruker官方丝状真菌数据库(v1.0)。对MALDI-TOF MS鉴定结果的判读采用Bruker推荐的COV，即判定分值＞2.0可实现种水平鉴定、判定分值为1.7~2.0可实现属水平鉴定，判定分值＜1.7则无法实现鉴定。

    图  1  MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌的菌落取材部位(A，方框)和取材量(B)
    MALDI-TOF MS:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
    下载: 全尺寸图片 幻灯片
    1.3.4   调整MALDI-TOF MS判定COV

    下调MALDI-TOF MS鉴定结果判读标准，将种水平判定COV由＞2.0下调至＞1.7，属水平判定COV由1.7~2.0下调至1.4~1.7，判定分值＜1.4则无法实现鉴定。分别采用Bruker推荐的COV和调整后的COV判读受试菌株MALDI-TOF MS鉴定结果，分析标准COV和调整后COV在MALDI-TOF MS丝状真菌鉴定率上的差异。

    1.4   统计学处理

    采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料用频数(百分数)表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

    2.   结果

    2.1   4种菌株培养条件对丝状真菌鉴定结果的影响

    Bruker MALDI-TOF MS对78株受试丝状真菌的种水平鉴定率在4种培养条件下为17.9%(14/78)至28.2%(22/78)不等，属水平鉴定率为43.6%(34/78)至51.3%(40/78)不等(表 1)，整体鉴定率在4种培养条件间差异并不显著(χ2=6.997，P=0.321)。进一步分析显示，MALDI-TOF MS对丝状真菌的鉴定率在SDA和PDA两种培养基间无显著性差异(χ2=0.467，P=0.792)，但28 ℃培养温度下的整体鉴定率均高于35 ℃(χ2=7.195，P=0.027)。

    表  1  菌株培养条件对MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌能力的影响[n(%)]
    菌种 株数 SDA PDA
    28 ℃ 35 ℃ 28 ℃ 35 ℃
    种水平 属水平 无法鉴定 种水平 属水平 无法鉴定 种水平 属水平 无法鉴定 种水平 属水平 无法鉴定
    曲霉 67 21(31.3) 31(42.3) 15(22.4) 15(22.4) 32(47.8) 20(29.8) 19(28.4) 34(50.7) 14(20.9) 14(20.9) 34(50.7) 19(28.4)
      烟曲霉 39 7 23 9 6 21 12 9 21 9 4 23 12
      黄曲霉 13 7 4 2 5 5 3 5 7 1 6 5 2
      黑曲霉 7 3 1 3 2 2 3 2 3 2 1 3 3
      土曲霉 4 1 2 1 0 2 2 1 1 2 1 1 2
      构巢曲霉 3 3 0 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0
      杂色曲霉 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0
    镰刀菌 7 1(14.3) 4(57.1) 2(28.6) 0(0) 2(28.6) 5(71.4) 1(14.3) 5(71.4) 1(14.3) 0(0) 2(28.6) 5(71.4)
      茄病镰刀菌 3 1 1 1 0 1 2 1 2 0 0 1 2
      串珠镰刀菌 3 0 2 1 0 1 2 0 2 1 0 0 3
      层生镰刀菌 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
    接合菌 4 0(0) 2(50.0) 2(50.0) 0(0) 0(0) 4(100) 0(0) 1(25.0) 3(75.0) 0(0) 1(25.0) 3(75.0)
      小孢根霉 2 0 1 1 0 0 2 0 0 2 0 0 2
      卷枝毛霉 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
      总状共头霉 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1
    总计 78 22(28.2) 37(47.4) 19(24.4) 15(19.3) 34(43.6) 29(37.2) 20(25.6) 40(51.3) 18(23.1) 14(17.9) 37(47.4) 27(34.6)
    MALDI-TOF MS：同图 1；SDA:沙堡弱葡萄糖琼脂；PDA:土豆葡萄糖琼脂
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    2.2   培养天数对丝状真菌鉴定结果的影响

    以受试菌株SDA 28 ℃培养条件为基础，分别于培养第2、3、4、5天和第7天对目的菌落取材进行MALDI-TOF MS鉴定，不同培养天数下得到的MALDI-TOF MS鉴定率存在显著性差异(χ2=139.032，P＜0.01)，其中培养第2、3天种水平(40.3%和34.3%)和属水平(44.8%和46.3%)鉴定率均较高；随着培养天数延长，受试菌株的MALDI-TOF MS种水平和属水平鉴定率均呈现下降趋势，这一现象在快速生长接合菌中尤为突出。培养至第7天，MALDI-TOF MS对受试菌株已无法实现种水平鉴定，仅14.1%(11/78)菌株可实现属水平鉴定(表 2)。

    表  2  培养天数对MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌能力的影响[n(%)]
    菌种 株数 第2天 第3天 第4天 第5天 第7天
    种水平 属水平 种水平 属水平 种水平 属水平 种水平 属水平 种水平 属水平
    曲霉 67 27(40.3) 30(44.8) 23(34.3) 31(46.3) 9(13.4) 30(44.8) 3(4.5) 21(31.3) 0(0) 8(11.9)
      烟曲霉 39 12 21 10 21 5 15 0 11 0 2
      黄曲霉 13 6 5 6 4 2 5 1 5 0 3
      黑曲霉 7 4 2 3 3 0 5 0 2 0 0
      土曲霉 4 1 2 0 3 0 3 0 1 0 0
      构巢曲霉 3 3 0 3 0 2 1 2 1 0 3
      杂色曲霉 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0
    镰刀菌 7 3(42.9) 4(57.1) 2(28.6) 5(71.4) 1(14.3) 4(57.1) 0(0) 4(57.1) 0(0) 3(42.9)
      茄病镰刀菌 3 2 1 1 2 0 2 0 2 0 1
      串珠镰刀菌 3 1 2 1 2 1 1 0 2 0 2
      层生镰刀菌 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0
    接合菌 4 0(0) 4(100) 0(0) 4(100) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0)
      小孢根霉 2 0 2 0 2 0 0 0 0 0 0
      卷枝毛霉 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0
      总状共头霉 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0
    总计 78 30(38.5) 38(48.7) 25(32.1) 40(51.8) 10(12.8) 34(43.6) 3(3.8) 25(32.1) 0(0) 11(14.1)
    MALDI-TOF MS：同图 1
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    2.3   结果判定截断值对丝状真菌鉴定结果的影响

    以受试菌株SDA 28 ℃培养3 d的MALDI-TOF MS鉴定结果为基础，分别采用Bruker推荐的COV和调整后的COV对鉴定结果进行分析判读。其中，将种水平判定COV由＞2.0下调至＞1.7后，受试菌株种水平鉴定率由32.1%(25/78)显著提升至85.9%(67/78)(χ2=40.119，P＜0.01)；另一方面，虽然下调COV后导致受试菌株的种水平鉴定错误例数从2例增加至5例，但错误鉴定率为7.5%(5/67)，较标准COV情况下的8%(2/25)未无升高。将属水平判定COV从1.7~2.0下调至1.4~1.7后，并未导致属水平错误鉴定情况的发生。下调COV后，无法鉴定例数由11例(14.1%)降至2例(2.6%)，仅1株烟曲霉和1株黑曲霉因其MALDI-TOF MS判定分值＜1.4而无法实现属水平鉴定(表 3)。

    表  3  结果判定截断值对MALDI-TOF MS丝状真菌鉴定能力的影响[n(%)]
    菌种 株数 Bruker推荐截断值 调整后截断值
    种水平(＞2.0) 属水平(1.7~2.0) 种水平(＞1.7) 属水平(1.4~1.7)
    曲霉属 67 23(34.3) 33(49.3) 56(83.6) 9(13.4)
      烟曲霉 39 10 23 33 5
      黄曲霉 13 6# 4 10* 3
      黑曲霉 7 3 3 6 0
      土曲霉 4 0 3 3 1
      构巢曲霉 3 3 0 3 0
      杂色曲霉 1 1 0 1 0
    镰刀菌 7 2(28.6) 5(71.4) 7(100) 0(0)
      茄病镰刀菌 3 1 2 3 0
      串珠镰刀菌 3 1# 2 3# 0
      层生镰刀菌 1 0 1 1# 0
    接合菌 4 0(0) 4(100) 4(100) 0(0)
      小孢根霉 2 0 2 2 0
      卷枝毛霉 1 0 1 1# 0
      总状共头霉 1 0 1 1 0
    总计 78 25(32.1) 42(53.8) 67(85.9) 9(11.5)
    *其中2株黄曲霉被错误鉴定为米曲霉；#其中1株黄曲霉被错误鉴定为米曲霉，1株串珠镰刀菌被错误鉴定为茄病镰刀菌，1株层生镰刀菌被错误鉴定为串珠镰刀菌，1株卷枝毛霉被错误鉴定为多分枝毛霉
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    3.   讨论

    本研究显示，受试菌株在SDA和PDA两种培养基间的MALDI-TOF MS鉴定率无显著性差异，但28 ℃培养温度下的鉴定率高于35 ℃(χ2=7.195，P=0.027)；培养第2、3天种水平(40.3%和34.3%)和属水平(44.8%和46.3%)鉴定率均较高；将MALDI-TOF MS种水平判定COV由＞2.0下调至＞1.7后，受试菌株种水平判定率显著提升(85.9%比32.1%，χ2=40.119，P < 0.01)且不增加错误鉴定率。

    本研究共收集78株丝状真菌临床分离株，菌种分布情况基本可覆盖临床常见丝状真菌。分别从受试菌株培养条件和培养天数评估其对MALDI-TOF MS鉴定率的影响，其中不同培养基间得到的MALDI-TOF MS丝状真菌鉴定力无显著性差异，但培养温度以28 ℃为佳，此时得到的种水平鉴定率较35 ℃条件下高出10%。就受试菌株培养天数而言，随着天数延长，MALDI-TOF MS对受试菌株的种水平及属水平鉴定率均呈显著下降趋势。究其原因，可能与本研究采用Bruker MALDI-TOF MS商业丝状真菌数据库，该数据库的建库谱图均是基于丝状真菌液体培养后收集菌丝体进行MALDI-TOF MS分析获得有关，然而液体培养法在国内大多数真菌实验室并未开展。前期有研究表明，曲霉等丝状真菌的孢子成分和菌丝成分在MALDI-TOF MS峰图上存在差异[15]，导致这一现象的原因可能为二者处于不同的生物阶段，且二者细胞结构不同。35 ℃培养条件更利于曲霉等丝状真菌产孢而28 ℃适合丝状真菌菌丝体生长，且无论在何种培养温度下，随着培养天数延长，丝状真菌产孢更加丰富，菌丝体的生长则相应减缓，培养2~3 d的菌落较易获得菌丝体成分，而培养4~5 d的菌落表面覆盖大量孢子粉，很难取到单纯菌丝成分。为了更好地利用Bruker丝状真菌数据库，建议以SDA或PDA 28 ℃培养2~3 d的新鲜稚嫩丝状真菌菌落进行MALDI-TOF MS鉴定。

    继往有研究表明，Bruker MALDI-TOF MS推荐的COV标准针对丝状真菌鉴定略为苛刻，致使菌株种水平鉴定率不高。本研究中，采用Bruker推荐COV时，仅32.1%(25/78)受试菌株因判定分值＞2.0而得到了种水平鉴定。若舍弃判定分值这一因素，单纯将菌株MALDI-TOF MS鉴定结果与测序鉴定结果进行比较，发现绝大多数经Bruker MALDI-TOF MS仅实现属水平鉴定的菌株其鉴定结果在种水平亦正确；部分经Bruker无法实现鉴定的菌株实则在属水平鉴定正确。这一现象在多个相关研究中已有发现，研究人员多通过调整COV标准将这一部分菌株的鉴定结果予以归正[10-12]。本研究分别对种水平和属水平COV进行下调，其中种水平COV由分值＞2.0降至＞1.7，属水平COV调整至1.4~1.7，通过与Bruker推荐的COV进行比较，下调COV后，受试丝状真菌的种水平鉴定率由32.1%显著提升至85.9%，但种水平错误鉴定率较标准COV未升高，且错误鉴定情况均发生在同一属内进化关系较近的菌种，如隶属于黄曲霉复合群中的黄曲霉和米曲霉，有研究表明对于二者的鉴别区分需通过分子测序手段[16]。下调COV后并未导致受试菌株MALDI-TOF MS属水平错误鉴定情况的发生。

    综上所述，以Bruker MALDI-TOF MS及其商业丝状真菌数据库为基础，以SDA或PDA 28 ℃培养2~3 d并对菌落进行分析，以分值＞1.7作为种水平判定COV，可有效提高Bruker MALDI-TOF MS对丝状真菌的鉴定能力。

    利益冲突  无

  • 图  1   MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌的菌落取材部位(A，方框)和取材量(B)

    MALDI-TOF MS:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

    下载: 全尺寸图片 幻灯片

    表  1   菌株培养条件对MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌能力的影响[n(%)]

    菌种 株数 SDA PDA
    28 ℃ 35 ℃ 28 ℃ 35 ℃
    种水平 属水平 无法鉴定 种水平 属水平 无法鉴定 种水平 属水平 无法鉴定 种水平 属水平 无法鉴定
    曲霉 67 21(31.3) 31(42.3) 15(22.4) 15(22.4) 32(47.8) 20(29.8) 19(28.4) 34(50.7) 14(20.9) 14(20.9) 34(50.7) 19(28.4)
      烟曲霉 39 7 23 9 6 21 12 9 21 9 4 23 12
      黄曲霉 13 7 4 2 5 5 3 5 7 1 6 5 2
      黑曲霉 7 3 1 3 2 2 3 2 3 2 1 3 3
      土曲霉 4 1 2 1 0 2 2 1 1 2 1 1 2
      构巢曲霉 3 3 0 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0
      杂色曲霉 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0
    镰刀菌 7 1(14.3) 4(57.1) 2(28.6) 0(0) 2(28.6) 5(71.4) 1(14.3) 5(71.4) 1(14.3) 0(0) 2(28.6) 5(71.4)
      茄病镰刀菌 3 1 1 1 0 1 2 1 2 0 0 1 2
      串珠镰刀菌 3 0 2 1 0 1 2 0 2 1 0 0 3
      层生镰刀菌 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
    接合菌 4 0(0) 2(50.0) 2(50.0) 0(0) 0(0) 4(100) 0(0) 1(25.0) 3(75.0) 0(0) 1(25.0) 3(75.0)
      小孢根霉 2 0 1 1 0 0 2 0 0 2 0 0 2
      卷枝毛霉 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
      总状共头霉 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1
    总计 78 22(28.2) 37(47.4) 19(24.4) 15(19.3) 34(43.6) 29(37.2) 20(25.6) 40(51.3) 18(23.1) 14(17.9) 37(47.4) 27(34.6)
    MALDI-TOF MS：同图 1；SDA:沙堡弱葡萄糖琼脂；PDA:土豆葡萄糖琼脂
    下载: 导出CSV

    表  2   培养天数对MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌能力的影响[n(%)]

    菌种 株数 第2天 第3天 第4天 第5天 第7天
    种水平 属水平 种水平 属水平 种水平 属水平 种水平 属水平 种水平 属水平
    曲霉 67 27(40.3) 30(44.8) 23(34.3) 31(46.3) 9(13.4) 30(44.8) 3(4.5) 21(31.3) 0(0) 8(11.9)
      烟曲霉 39 12 21 10 21 5 15 0 11 0 2
      黄曲霉 13 6 5 6 4 2 5 1 5 0 3
      黑曲霉 7 4 2 3 3 0 5 0 2 0 0
      土曲霉 4 1 2 0 3 0 3 0 1 0 0
      构巢曲霉 3 3 0 3 0 2 1 2 1 0 3
      杂色曲霉 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0
    镰刀菌 7 3(42.9) 4(57.1) 2(28.6) 5(71.4) 1(14.3) 4(57.1) 0(0) 4(57.1) 0(0) 3(42.9)
      茄病镰刀菌 3 2 1 1 2 0 2 0 2 0 1
      串珠镰刀菌 3 1 2 1 2 1 1 0 2 0 2
      层生镰刀菌 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0
    接合菌 4 0(0) 4(100) 0(0) 4(100) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0)
      小孢根霉 2 0 2 0 2 0 0 0 0 0 0
      卷枝毛霉 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0
      总状共头霉 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0
    总计 78 30(38.5) 38(48.7) 25(32.1) 40(51.8) 10(12.8) 34(43.6) 3(3.8) 25(32.1) 0(0) 11(14.1)
    MALDI-TOF MS：同图 1
    下载: 导出CSV

    表  3   结果判定截断值对MALDI-TOF MS丝状真菌鉴定能力的影响[n(%)]

    菌种 株数 Bruker推荐截断值 调整后截断值
    种水平(＞2.0) 属水平(1.7~2.0) 种水平(＞1.7) 属水平(1.4~1.7)
    曲霉属 67 23(34.3) 33(49.3) 56(83.6) 9(13.4)
      烟曲霉 39 10 23 33 5
      黄曲霉 13 6# 4 10* 3
      黑曲霉 7 3 3 6 0
      土曲霉 4 0 3 3 1
      构巢曲霉 3 3 0 3 0
      杂色曲霉 1 1 0 1 0
    镰刀菌 7 2(28.6) 5(71.4) 7(100) 0(0)
      茄病镰刀菌 3 1 2 3 0
      串珠镰刀菌 3 1# 2 3# 0
      层生镰刀菌 1 0 1 1# 0
    接合菌 4 0(0) 4(100) 4(100) 0(0)
      小孢根霉 2 0 2 2 0
      卷枝毛霉 1 0 1 1# 0
      总状共头霉 1 0 1 1 0
    总计 78 25(32.1) 42(53.8) 67(85.9) 9(11.5)
    *其中2株黄曲霉被错误鉴定为米曲霉；#其中1株黄曲霉被错误鉴定为米曲霉，1株串珠镰刀菌被错误鉴定为茄病镰刀菌，1株层生镰刀菌被错误鉴定为串珠镰刀菌，1株卷枝毛霉被错误鉴定为多分枝毛霉
    下载: 导出CSV
    • 参考文献(16)
  • [1]

    Taccone FS, Van den Abeele AM, Bulpa P, et al. Epidemiology of invasive aspergillosis in critically ill patients:clinical presentation, underlying conditions, and outcomes[J]. Crit Care, 2015, 19:7. DOI: 10.1186/s13054-014-0722-7
    [2]

    Liao Y, Chen M, Hartmann T, et al. Epidemiology of opportunistic invasive fungal infections in China:review of literature[J]. Chin Med J(Engl), 2013, 126:361-368. http://europepmc.org/abstract/med/23324290
    [3]

    Slavin M, van Hal S, Sorrell TC, et al. Invasive infections due to filamentous fungi other than Aspergillus:epidemiology and determinants of mortality[J]. Clin Microbiol Infect, 2015, 21:490.e1-e10. DOI: 10.1016/j.cmi.2014.12.021
    [4]

    Blum G, Hörtnagl C, Jukic E, Erbeznik T, et al. New insight into amphotericin B resistance in Aspergillus terreus[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57:1583-1588. DOI: 10.1128/AAC.01283-12
    [5]

    Martos AI, Romero A, González MT, et al. Evaluation of the Etest method for susceptibility testing of Aspergillus spp. and Fusarium spp. to three echinocandins[J]. Med Mycol, 2010, 48:858-861. DOI: 10.3109/13693781003586943
    [6]

    Alastruey-Izquierdo A, Castelli MV, Cuesta I, et al. In vitro activity of antifungals against Zygomycetes[J]. Clin Microbiol Infect, 2009, 15:71-76. DOI: 10.1111/j.1469-0691.2009.02984.x
    [7]

    Halliday CL, Chen SC, Kidd SE, et al. Antifungal susceptibilities of non-Aspergillus filamentous fungi causing invasive infection in Australia:support for current antifungal guide-line recommendations[J]. Int J Antimicrob Agents, 2016, 48:453-458. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2016.07.005
    [8]

    Singhal N, Kumar M, Kanaujia PK, et al. MALDI-TOF mass spectrometry:an emerging technology for microbial identification and diagnosis[J]. Front Microbiol, 2015, 6:791. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4525378/
    [9]

    Cassagne C, Normand AC, L'Ollivier C, et al. Performance of MALDI-TOF MS platforms for fungal identification[J]. Mycoses, 2016, 59:678-690. DOI: 10.1111/myc.12506
    [10]

    Schulthess B, Ledermann R, Mouttet F, et al. Use of the Bruker MALDI Biotyper for identification of molds in the clinical mycology laboratory[J]. J Clin Microbiol, 2014, 52:2797-2803. DOI: 10.1128/JCM.00049-14
    [11]

    Lau AF, Drake SK, Calhoun LB, et al. Development of a clinically comprehensive database and a simple procedure for identification of molds from solid media by MALDI-TOF MS[J]. J Clin Microbiol, 2013, 51:828-834. DOI: 10.1128/JCM.02852-12
    [12]

    Li Y, Wang H, Zhao YP, et al. Evaluation of the Bruker Biotyper Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry system for identification of Aspergillus species directly from growth on solid agar media[J]. Front Microbiol, 2017, 8:1209. DOI: 10.3389/fmicb.2017.01209
    [13] 李颖, 徐英春.评价ITS、BenA和CaM序列分析在曲霉菌种鉴定方面的应用[J].中国真菌学杂志, 2017, 12:74-77. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=zgzjxzz201702003
    [14] 李颖, 郭莉娜, 徐英春.内转录间隔区(ITS)序列分析技术对丝状真菌临床分离株鉴定能力的评估[J].中华微生物学和免疫学杂志, 2017, 37:607-610. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=zhwswxhmyx201708010
    [15]

    Alanio A, Beretti JL, Dauphin B, et al. MALDI-TOF MS for fast and accurate identification of clinically relevant Aspergillus species[J]. Clin Microbiol Infect, 2011, 17:750-755. DOI: 10.1111/j.1469-0691.2010.03323.x
    [16]

    Samson RA, Visagie CM, Houbraken J, et al. Phylogeny, identification and nomenclature of the genus Aspergillus[J]. Stud Mycol, 2014, 78:141-173. DOI: 10.1016/j.simyco.2014.07.004
    • 相关文章
    • 施引文献(6)

  • 期刊类型引用(4)

    1. 任婷，史敏，刘聪慧，黄一刚，裴金金. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在食源性致病菌鉴定中的应用. 食品安全质量检测学报. 2024(05): 62-68 . 百度学术
    2. 李丽，李秀惠，陈煜. 肝衰竭合并侵袭性真菌病的诊断策略. 中西医结合肝病杂志. 2021(01): 7-10+20 . 百度学术
    3. 李艳君，孙钊坤，丁赔赔，王姣贤，董蓉，赵强元. 自建MALDI-TOF MS霉菌数据库的研究. 国际检验医学杂志. 2021(06): 645-648+652 . 百度学术
    4. 李颖，黄晶晶，刘文静，王培昌，徐英春. MALDI-TOF MS自建数据库对丝状真菌临床分离株鉴定能力的评估. 中国真菌学杂志. 2021(06): 361-366 . 百度学术

    其他类型引用(2)

    • 资源附件(0)
图(1)  /  表(3)
计量
  • 文章访问数:  497
  • HTML全文浏览量:  53
  • PDF下载量:  143
  • 被引次数: 6
出版历程
  • 收稿日期:  2017-11-06
  • 刊出日期:  2020-03-29

目录

摘要
HTML全文

  • 1.   材料与方法

  • 1.1   菌株

  • 1.2   主要仪器与试剂

  • 1.3   具体操作

  • 1.3.1   菌株培养条件优化
  • 1.3.2   培养天数优化
  • 1.3.3   MALDI-TOF MS鉴定
  • 1.3.4   调整MALDI-TOF MS判定COV

  • 1.4   统计学处理

  • 2.   结果

  • 2.1   4种菌株培养条件对丝状真菌鉴定结果的影响

  • 2.2   培养天数对丝状真菌鉴定结果的影响

  • 2.3   结果判定截断值对丝状真菌鉴定结果的影响

  • 3.   讨论

参考文献(16)
相关文章
施引文献
资源附件(0)

/

返回文章
返回
友情链接: 国家卫生健康委员会 北京协和医院 中国医学科学院 学术不端检测系统 国际知识资源总库 中国知网 术语在线
地址：北京市东城区帅府园1号 北京协和医院老楼7号楼
3层302室 《协和医学杂志》编辑部
电话：010-69154261/4262
E - mail：medj@pumch.cn mjpumch@126.com
期刊网站版权所有：《协和医学杂志》编辑部
京ICP备 11002662

本系统由 北京仁和汇智信息技术有限公司 开发  百度统计

x 关闭 永久关闭