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Local Injections of Cholesterol-conjugated let-7a Mimics Inhibit Tumor Growth and Metastasis of Hepatocellular Carcinoma in a Subcutaneous Xenograft Nude Mouse Model by Targeting K-Ras, H-Ras, and N-Ras
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摘要:目的 研究胆固醇包裹let-7a模拟物(mimics)是否能通过下调人3种Ras抑制肝癌发展, 寻找肝癌的潜在治疗策略目的 采用MTT增殖分析、PI单染和Annexin V/FITC双染方法检测let-7a mimics在体外对肝癌细胞的作用。使用裸鼠皮下移植瘤模型和通过肿瘤局部注射方法观察let-7a mimics对体内肝癌的作用。采用实时定量PCR和Western blot方法检测let-7a及其靶点Ras的表达结果 与阴性对照组相比, let-7a mimics转染的肝癌细胞let-7a水平升高, 细胞增殖缓慢(P均 < 0.05);let-7a mimics阻滞更多肝癌细胞停留在G0-G1期且促进肝癌细胞凋亡(P均 < 0.05)。经let-7a mimics治疗的裸鼠体内肿瘤体积较阴性对照组减小, 是阴性对照组的54.97%(P=0.039);局部浸润和肝脏转移较阴性对照组明显减轻。肝癌细胞和移植瘤组织内let-7a上调的同时, 人K-Ras、H-Rras和N-Ras mRNA和蛋白的表达降低(P均 < 0.05)结论 let-7a mimics下调人3种Ras mRNA和蛋白的表达, 影响细胞周期, 进而抑制细胞增殖和促进细胞凋亡。瘤周多点注射胆固醇包裹的let-7a mimics能抑制移植瘤的生长、浸润和转移。提示let-7阻断Ras可成为肝癌治疗的研究策略。Abstract:Objective To investigate the potential antitumor effects of cholesterol-conjugated let-7a mimics (let-7a mimics) on hepatocellular carcinoma (HCC) by down-regulating all 3 human Ras, with the aim to explore alternative therapeutic strategy for HCC.Methods Effects of let-7a mimics on HCC cells in vitro were detected using MTT-based cell proliferation assays in combination with propidium iodide staining and annexin-V/FITC double staining. The antitumor effects in vivo of let-7a mimics on HCC growth were analyzed in subcutaneous xenograft nude mice with intra-tumoral injections. Expressions of let-7a and its target human Ras were examined with real-time PCR and Western blot.Results let-7a mimics-transfected HCC cells showed increased let-7a levels and slower proliferation compared with the negative controls (both P < 0.05). let-7a mimics induced more cell-cycle arrest at the G0-G1 phase and promoted apoptosis of HCC cells (both P < 0.05). In addition, significant reductions in tumor size, local invasion and metastasis to liver were observed in let-7a mimics-treated nude mice compared to negative controls. The tumor size after let-7a treatment was 54.97% that of negative controls (P=0.039). Furthermore, the up-regulation of let-7a coincided with the reduction of K-Ras, H-Rras, and N-Ras mRNA and protein expressions in HCC cells and xenograft tumor (all P < 0.05).Conclusions let-7a mimics could affect cell cycle, inhibit cell proliferation and promote cell apoptosis by downregulation of mRNA and protein expressions of all the 3 human Ras. Local injections of cholesterol-conjugated let-7a mimics could effectively suppress the growth, invasion and metastasis of xenograft tumor. These findings suggest that Ras-targeting let-7 mimics could be a potential therapeutic option for HCC.
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Keywords:
- hepatocellular carcinoma /
- let-7a /
- K-Ras /
- H-Ras /
- N-Ras /
- cell cycle /
- local injection treatment
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神经病理性疼痛是由神经系统原发性损害和功能障碍所激发或引起的疼痛。神经系统与免疫系统之间的相互作用，为治疗神经病理性疼痛提供了新的靶点。在中枢神经系统，Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2) /信号转导和转录激活子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)通路导致炎症、肿瘤及神经退行性变[1]，并且参与神经病理性疼痛的形成过程。细胞因子信号抑制因子(suppressors of cytokine signaling，SOCS)是一类对细胞因子和生长相关因子信号转导通路起负性调节的蛋白家族，尤其是SOCS3对JAK/STAT信号通路发挥负反馈调节作用，参与抑制炎症及凋亡等保护作用。本研究组前期研究发现，JAK2/STAT3在大鼠双侧坐骨神经结扎(bilateral chronic sciatic nerve constriction injury, bCCI)模型中是激活的[2]。WP1066是一种新的且具有细胞渗透性的AG490衍生物。但是与AG490不同，WP1066除了能够有效抑制STAT3信号通路，还可以降解JAK2蛋白，从而阻止下游STAT3通路的激活。此外，正常细胞活性不受WP1066的影响, 其作用是增强免疫的细胞毒性，而不是体液反应。WP1066可通过血脑屏障，也有研究表明WP1066治疗癫痫有效[3]，提示WP1066可以作为一种大脑损伤后的治疗手段。但是目前尚未见该抑制剂用于治疗神经病理性疼痛的相关研究报道。因此，本研究通过观察WP1066对神经病理性疼痛的影响，旨在为治疗神经病理性疼痛寻找新的方案。
材料和方法
实验动物
SPF级健康雌性SD大鼠，体重180~200 g，由北京动物研究所[许可证SCXK(京)：20022003]提供，饲养于北京协和医院动物实验中心。室温22 ℃左右，相对湿度50%左右，明暗各12 h，自由摄水和食物，每日更换笼具和垫料。适应环境3~5 d后行鞘内置管。
鞘内置管
采用腹腔注射戊巴比妥钠40~50 mg/kg麻醉大鼠。取俯卧位，消毒，铺巾，在无菌操作下以大鼠脊柱正中髂嵴连线水平为中心作纵切口，切开皮肤，打开筋膜，分离肌肉，暴露L5~L6棘突间隙，分离棘间韧带后暴露黄韧带。用去尖磨钝的22G针头穿刺黄韧带，观察到大鼠身体突然抽动或甩尾后立即拔针，用镊子轻柔地将PE-10导管向头侧置入蛛网膜下腔内约3 cm，见脑脊液流出或注入生理盐水可见脑脊液回流，证实导管通畅后封闭管口，在髂嵴处用丝线固定。用止血钳作一皮下隧道，将导管沿隧道前端穿出，固定于皮肤。局部生理盐水冲洗切口，间断缝合肌肉筋膜、皮下组织及皮肤；术毕将大鼠放入单笼，于温暖、安静环境中自由喂养。手术由同一人操作以保证一致性。
鞘内管一直保留至实验结束，术后观察2 d以排除伤口感染、鞘内感染、鞘内管阻塞、脱位、痛觉异常和运动障碍大鼠，没有异常表现的大鼠鞘内注射2%利多卡因10 μl，如注药30 s内未出现双后肢麻痹，则认为鞘内置管失败，弃去不用。注药后出现双后肢麻痹的动物分笼单独饲养，即可用于实验。实验结束后剖开大鼠腰椎再次确认导管位置。
双侧坐骨神经结扎手术
按照随机数字表法将12只SD大鼠随机分为WP1066组及对照组，每组6只，两组均进行bCCI手术。戊巴比妥40~50 mg/kg进行腹腔注射麻醉后，消毒，铺巾，在距坐骨神经起始处(三支分叉处)上方2 mm用4.0含铬羊肠线结扎神经4道，每两道之间间隔约1 mm，使被结扎的神经长约4~5 mm。在解剖显微镜(×40)下观察可见坐骨神经表面的动脉轻度受压，但血流没有中断；注意结扎的松紧度, 以打结时可见切口周围暴露的肌肉产生轻微抽动为准；间断缝合；对侧同样操作。手术由同一人操作。
鞘内给药
WP1066组及对照组分别于术前1d、术前、术后3 d、术后5 d经鞘内管给予容量为10 μl的WP1066(Santa-Ctuze, 美国，10 mmol/L溶于二甲基亚砜)或10 μl的二甲基亚砜。
行为学观察
两组均于bCCI模型手术前1 d及术后3、5、7、10、14 d进行动物行为学测量及观察。
机械刺激诱发痛测定：采用电子von Frey测痛仪测定。参照Vivancos等[4]方法，大鼠安静地适应环境10~30 min后，用金属探头垂直刺激大鼠左、右后脚底。刺激强度逐渐增大，大约3 s内使大鼠后脚产生快速缩足、扬足或舔足反应。记录仪自动记录使大鼠产生缩足反射的最小刺激强度。反复该刺激动作，直至记录仪记录到3次数值类似的测试值。将3次读数取平均值作为机械缩足反射阈值。
热刺激诱发痛测定：采用BME-410A热照射疼痛刺激仪测定。大鼠安静地适应环境10~30 min后，用热测痛仪照射大鼠左、右后脚底，待大鼠产生快速缩足、扬足或舔足后停止照射，记录下照射持续时间即为缩足反射的潜伏期。每足重复测量3次，每两次测量至少间隔3 min。将3次读数取平均值作为热刺激伤害感受阈值，最高阈值设为20 s，因高于20 s对正常大鼠也可以引起疼痛。
冷刺激诱发痛测定：参照Datta等[5]方法，大鼠适应环境15 min后，用带有软管接头的1 ml注射器，将0.1 ml丙酮轻柔地滴加在大鼠后足上。随着丙酮在大鼠脚掌的扩散，大鼠出现抬足、缩足、快速甩足以及甩足后舔足等反应视为阳性表现，间隔2 min重复1次，每只后足重复3次。记录每只大鼠后足3次丙酮刺激后出现阳性表现的次数，作为冷痛阈值。
动物处死及取材
术后第14天，腹腔注射2.5%戊巴比妥钠(剂量约40 mg/kg)，深度麻醉后断头处死大鼠。取俯卧位，迅速剪开背部皮肤，沿棘突切开皮肤及皮下组织，用咬骨钳分别咬去椎板及椎弓根, 暴露脊髓，小心取出L4~L6腰膨大脊髓背角, 立即放入液氮冷却5~10 min后放入-80 ℃冰箱保存。
RT-PCR反应
Trizol法提取RNA：分别提取WP1066组和对照组L4~L6腰膨大脊髓背角的RNA。用紫外分光光度仪测定每个RNA样本浓度并进行质量鉴定。如RNA样本的OD260/OD280值在1.8~2.1之间，则认为RNA的纯度较好，否则弃之不用，记录合格样本的RNA浓度。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，通过凝胶成像系统检测所提取的RNA，可观察到28S和18S核糖体RNA带亮而浓。
cDNA合成：合格RNA样本按照PrimeScriptTM RT Master Mix(Takara DRR036A，塔克拉，日本)说明加入试剂，反应条件为37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃，到无穷；进行逆转录反应合成cDNA。
RT-PCR：引物设计选用GAPDH基因作为内参，运用Primer Premier 5.0和Oligo 6软件进行引物设计，各基因引物设计见表 1。cDNA模板按照SYBR Premix ExTaqTMⅡ(Takara RR820A，塔克拉，日本)说明进行RT-PCR反应，每个样品同时做3个复管。将所测标本放入AB Applied Biosystems Step-one plus(ABI，美国)进行PCR反应，反应条件包括预变性：95 ℃ 30 s；PCR反应：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s；循环40个反应体系；溶解：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反应结束后，电脑自动分析荧光信号并将其转换为Ct值。PCR结束后分别运行熔解曲线确定PCR产物的特异性，另将反应产物经琼脂糖凝胶电泳再次确认其单一性；各样品的目的基因和内参基因分别进行反应。计算各样品目的基因和内参基因的相对浓度。
表 1 RT-PCR目的基因引物序列引物名称 引物序列 STAT3-F 5′-TACCACAAAAGTCAGGTTGCTG-3′ STAT3-R 5′-ACATCCCCAGAGTCCTTATCAA-3′ SOCS3-F 5′-GAGAGCGGATTCTACTGGAGTG-3′ SOCS3-R 5′-GTCACTGCGCTCCAGTAGAAG-3′ JAK2-F 5′-GGTTCATTCAGCAGTTCAGTCA-3′ JAK2-R 5′-GCAGGGTCTCCAGGTTTATG-3′ IL-6-R 5′-TCTTGGGACTGATGTTGTTGAC-3′ IL-6-F 5′-TGGGTGGTATCCTCTGTGAAGT-3′ Western blot
组织中总蛋白的提取：用干净的剪刀将脊髓背角组织块尽量剪碎(冰上操作)。按照每20 μg加150~250 μl RIPA(或单去污剂)裂解液(加蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂)进行匀浆。裂解后4 ℃下12 000转/min(r=13.5 cm)离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中。使用BCA法，通过微孔酶标仪制作标准曲线测定蛋白浓度。
SDS-PAGE电泳：按照分子量大小选择配8%或12%分离胶，取40 μg样品及8 μl彩染蛋白分子量指示标准SDS-PAGE胶(10 cm×10 cm)上样。80 V电压电泳直到跑出浓缩胶，120 V电压电泳直至蛋白指示剂移动到胶的底部。300 mA恒流转膜75 min，5%脱脂牛奶室温封闭1 h。一抗4 ℃过夜，分别为抗pSTAT3抗体(1: 500; Cell Signaling Technology)、抗STAT3抗体(Tyr705, 1: 500; Cell Signaling Technology)、抗SOCS3抗体(1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Inc)、抗JAK2抗体(1: 500; Santa Cruz Biotechnology, Inc)。TBST缓冲液清洗3遍，二抗孵育，轻度震荡，室温放置1 h。ImageQuant LAS 4000mini凝胶成像仪进行曝光。
统计学处理
数据分析采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0软件进行；表格绘制使用Excel软件。对于定量资料，数据使用均数±标准差表示，对于不同组间的机械痛阈、热痛阈的比较采用重复测量方差分析，再进行配对t检验，对于冷刺激诱发痛的数据分析采用卡方检验(Pearson chi-squared test)进行比较。实时PCR结果采用ABI Step-one plus自带软件进行数据分析，之后采用2-ΔΔCT法计算基因表达量，再进行配对t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
结果
两组大鼠动物行为学变化
大鼠bCCI手术前后左右后足平均机械痛阈值、热刺激伤害感受阈值、冷刺激反应差异均无统计学意义(P＞0.05)。与对照组相比，WP1066组机械缩足反射阈值从第3天开始明显升高，差异具有统计学意义(P < 0.05)；热刺激缩足反射潜伏期从第5天开始明显升高，差异具有统计学意义(P < 0.05)；冷痛阈值从第5天开始明显升高，差异具有统计学意义(P < 0.05)(图 1)。
两组大鼠脊髓背角STAT3、SOCS3、JAK2及IL-6 mRNA表达
对照组及WP1066组STAT3 mRNA相对表达量分别为1.97±0.14与1.03±0.08；SOCS3 mRNA相对表达量分别为3.32±1.12和1.02±0.19；JAK2 mRNA相对表达量分别为3.49±0.89和1.62±1.27，与对照组相比，WP1066组STAT3、SOCS3、JAK2 mRNA表达均明显降低，差异有统计学意义(P均 < 0.05)。WP1066组IL-6 mRNA表达较对照组稍升高，相对表达量分别为1.62±1.27和1.36±0.36，差异亦具有统计学意义(P < 0.05)。
两组大鼠脊髓背角pSTAT3、STAT3、SOCS3及JAK2蛋白水平
以GAPDH为内参基因，观察两组大鼠脊髓背角pSTAT3、STAT3、SOCS3及JAK2蛋白表达变化，结果显示，与对照组相比，WP1066组pSTAT3、SOCS3、JAK2蛋白水平均明显降低，差异均具有统计学意义(P均 < 0.05)；STAT3蛋白水平亦有所降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)(图 2)。
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图 2 靶蛋白在大鼠脊髓背角的表达情况A.pSTAT3；B.STAT3；C.SOCS3；D.JAK2
STAT3：信号转导和转录激活子3；pSTAT3：磷酸化STAT3；SOCS3：细胞因子信号抑制因子3；JAK2：Janus激酶2;Mr:相对分子质量；与对照组比较，*P < 0.05讨论
本研究组前期研究发现JAK2/STAT3通路在bCCI神经病理性疼痛模型中是激活的[2]，本研究尝试探求JAK2/STAT3抑制剂对神经病理性疼痛的影响。结果与研究假设相符，发现JAK2/STAT3抑制剂WP1066可以较好地改善神经病理性疼痛阈值，并且WP1066对通路的影响符合预期分子机制。
与传统的神经病理性疼痛模型相比，本研究采用的bCCI模型为双侧模型，虽相关研究较少，但更具备合理性。一方面，随着大鼠体重的日益增加，手术侧重量与非手术侧重量失衡，导致手术侧对刺激的敏感度失真，造成结果的失真。另一方面，动物取材为大鼠脊髓背角，双侧取材比单侧取材更具有精确性。因此利用bCCI模型建立神经病理性疼痛大鼠模型更具优越性。并且，疼痛持续时间越长，这种优势越明显。此外，本研究采用180~200 g雌性SD大鼠，则是由于雌性、小体重鼠对疼痛更为敏感。选择术后第14天取材是由于bCCI模型术后第14天疼痛阈值达到最低点，且前期研究发现目的基因在第14天变化最显著。
与单侧CCI模型相比，bCCI模型对冷刺激出现痛觉过敏[6]。Aδ纤维参与冷刺激[7]。bCCI疼痛模型对冷刺激的反应包括两个阶段[5]：早期表现为机械和冷刺激敏感，晚期(＞30 d)表现为长时间冷痛觉过敏及接触痛。本研究定在早期阶段。有研究表明，冷刺激过敏与TRPM8在神经元上表达有关[8]。本研究表明bCCI神经病理性疼痛模型中，WP1066可在mRNA水平及蛋白水平抑制JAK2/STAT3通路的活化。SOCS3与JAK2/STAT3通路之间是负反馈调节。WP1066，无论是在mRNA水平还是蛋白水平均可以显著降低SOCS3的含量。也可能提示此通路相关蛋白在冷痛觉传导中发挥作用。
机械痛感和热痛感是以Aδ纤维和C纤维为痛感受器[9]通过背根到达脊髓背角。bCCI疼痛模型对热过敏可能与Wallerian样变性及巨噬细胞浸润神经相关[10]。从人胶质细胞瘤上分离的小胶质细胞和星形胶质细胞缺乏CD86和CD80，从而不能激活天然T细胞。而在其他神经病理性疼痛模型中，发现脊髓小胶质细胞[11]及星形胶质细胞[12]参与JAK2/STAT3通路的活化。WP1066作用机制为抑制JAK2/STAT3通路，使T细胞功能化[13]，从而发挥抗炎镇痛作用。本研究也发现WP1066可在mRNA水平及蛋白水平抑制JAK2/STAT3通路的活化，符合预期结果。IL-6在神经病理疼痛的发生发展中与热痛觉及机械痛关系密切，在神经病理性疼痛中起着重要作用。Dubovy等[14]在大鼠CCI模型发现除了L4~L5脊髓背角神经元IL-6激活，还可通过激活STAT3通路，导致神经病理性疼痛的发生。Dominguez等[12]发现结扎脊神经L5~ L6会导致3、7、14 d后脊髓背根神经节IL-6 mRNA的表达均显著升高。但是，本研究发现WP1066对IL-6 mRNA的影响与预期相反，分析IL-6水平的升高可能由其他原因造成。
本研究在bCCI大鼠给药后，大鼠双足热刺激诱发痛阈值、机械刺激缩足反射阈值均出现显著恢复，大鼠神经病理性疼痛明显减轻。预实验时分别鞘内给予0、5、10、15 μl的WP1066，结果显示与10 μl剂量相比，15 μl剂量时疼痛行为学并未出现明显改善，反而出现剂量依赖型体重下降。因此最终采用鞘内注射剂量为10 μl。
近年来，银杏肉碱B[15]和雷公藤[16]均被证明可通过JAK2/STAT3通路发挥脊髓损伤后的神经保护作用，提示JAK2/STAT3通路抑制剂可能在治疗神经病理性疼痛中有一定的潜力。WP1066对JAK2/STAT3信号通路的影响，可为神经病理性疼痛的有效治疗提供新靶点。但由于WP1066价格昂贵，且对皮肤黏膜有一定的刺激作用，所以本研究采用经鞘内给药的方法，未来可尝试使用新的剂型应用于临床。
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图 1 let-7a mimics对两种肝癌细胞的增殖、细胞周期和凋亡的影响
A.肝癌细胞MTT生长曲线分析；B.let-7a mimics对肝癌细胞周期的影响
let-7a: let-7a mimics治疗组；NC-Ctrl:阴性对照组![]()
图 2 let-7a mimics对裸鼠皮下肝癌移植瘤的影响
A.裸鼠皮下移植瘤生长曲线；B.局部注射给药4周，移植瘤实验结束后移植瘤大小及其侵及皮肤溃疡情况；C.移植瘤组织病理学，蓝色箭头示坏死区，黄色箭头示细胞分裂象(HE染色)
let-7a、NC-Ctrl:同图 1 -
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