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Local Injections of Cholesterol-conjugated let-7a Mimics Inhibit Tumor Growth and Metastasis of Hepatocellular Carcinoma in a Subcutaneous Xenograft Nude Mouse Model by Targeting K-Ras, H-Ras, and N-Ras
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摘要:目的 研究胆固醇包裹let-7a模拟物(mimics)是否能通过下调人3种Ras抑制肝癌发展, 寻找肝癌的潜在治疗策略目的 采用MTT增殖分析、PI单染和Annexin V/FITC双染方法检测let-7a mimics在体外对肝癌细胞的作用。使用裸鼠皮下移植瘤模型和通过肿瘤局部注射方法观察let-7a mimics对体内肝癌的作用。采用实时定量PCR和Western blot方法检测let-7a及其靶点Ras的表达结果 与阴性对照组相比, let-7a mimics转染的肝癌细胞let-7a水平升高, 细胞增殖缓慢(P均 < 0.05);let-7a mimics阻滞更多肝癌细胞停留在G0-G1期且促进肝癌细胞凋亡(P均 < 0.05)。经let-7a mimics治疗的裸鼠体内肿瘤体积较阴性对照组减小, 是阴性对照组的54.97%(P=0.039);局部浸润和肝脏转移较阴性对照组明显减轻。肝癌细胞和移植瘤组织内let-7a上调的同时, 人K-Ras、H-Rras和N-Ras mRNA和蛋白的表达降低(P均 < 0.05)结论 let-7a mimics下调人3种Ras mRNA和蛋白的表达, 影响细胞周期, 进而抑制细胞增殖和促进细胞凋亡。瘤周多点注射胆固醇包裹的let-7a mimics能抑制移植瘤的生长、浸润和转移。提示let-7阻断Ras可成为肝癌治疗的研究策略。Abstract:Objective To investigate the potential antitumor effects of cholesterol-conjugated let-7a mimics (let-7a mimics) on hepatocellular carcinoma (HCC) by down-regulating all 3 human Ras, with the aim to explore alternative therapeutic strategy for HCC.Methods Effects of let-7a mimics on HCC cells in vitro were detected using MTT-based cell proliferation assays in combination with propidium iodide staining and annexin-V/FITC double staining. The antitumor effects in vivo of let-7a mimics on HCC growth were analyzed in subcutaneous xenograft nude mice with intra-tumoral injections. Expressions of let-7a and its target human Ras were examined with real-time PCR and Western blot.Results let-7a mimics-transfected HCC cells showed increased let-7a levels and slower proliferation compared with the negative controls (both P < 0.05). let-7a mimics induced more cell-cycle arrest at the G0-G1 phase and promoted apoptosis of HCC cells (both P < 0.05). In addition, significant reductions in tumor size, local invasion and metastasis to liver were observed in let-7a mimics-treated nude mice compared to negative controls. The tumor size after let-7a treatment was 54.97% that of negative controls (P=0.039). Furthermore, the up-regulation of let-7a coincided with the reduction of K-Ras, H-Rras, and N-Ras mRNA and protein expressions in HCC cells and xenograft tumor (all P < 0.05).Conclusions let-7a mimics could affect cell cycle, inhibit cell proliferation and promote cell apoptosis by downregulation of mRNA and protein expressions of all the 3 human Ras. Local injections of cholesterol-conjugated let-7a mimics could effectively suppress the growth, invasion and metastasis of xenograft tumor. These findings suggest that Ras-targeting let-7 mimics could be a potential therapeutic option for HCC.
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Keywords:
- hepatocellular carcinoma /
- let-7a /
- K-Ras /
- H-Ras /
- N-Ras /
- cell cycle /
- local injection treatment
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视网膜脱离是视网膜神经上皮层和色素上皮层之间的分离。视网膜下液聚积是所有视网膜脱离的共同特征，通常由视网膜裂孔、牵拉、渗出等因素引起。视网膜脱离后，视细胞营养发生障碍，如不及时复位, 整个神经上皮层会出现萎缩和变性, 造成视功能不可逆性损害, 最终导致视力丧失。与其他治疗手段相比, 及时的视网膜复位手术将是恢复视功能的最佳手段。本研究即探讨本院2011年10月至2012年9月间手术治疗68例70只眼视网膜脱离的疗效。
对象和方法
对象
2011年10月至2012年9月于本院眼科确诊并接受手术治疗的视网膜脱离患者68例70只眼。其中男性39例, 女性29例; 年龄19~77岁, 平均(52.1± 9.2)岁。单眼发病66例, 双眼发病2例, 其中右眼42只, 左眼28只。孔源性视网膜脱离者55只眼(包括黄斑孔者14只眼, 其中伴高度近视者12只眼), 牵拉性视网膜脱离者5只眼, 渗出性视网膜脱离者2只眼, 牵拉裂孔性视网膜脱离者8只眼。病程最长者半年, 最短者3d, 中位时间21d。
手术前视力:无光感1只眼, 光感1只眼, 手动5只眼, 数指39只眼, 0.02~0.05者5只眼, 0.05~ 0.1者8只眼, .1~0.3者6只眼, 0.3以上者5只眼。均为最佳矫正视力。
视网膜脱离情况:根据硅油研究组提出的增生性玻璃体视网膜病变分类系统[1]:B级1只眼, CP1型2只眼, CP2型3只眼, CA1型6只眼, CA2型12只眼, CP1+CA2型10只眼, CP2+CA1型2只眼, CP2+CA2型8只眼, CP3+CA2型7只眼, CP3+ CA3型6只眼, CP4+CA2型2只眼, CP4+CA3型7只眼, CP4+CA4型4只眼。
视网膜脱离类型:孔源性视网膜脱离患者中, 黄斑裂孔者14只眼, 颞上方裂孔者18只眼, 颞下方裂孔者7只眼, 鼻下方裂孔者3只眼, 鼻上方裂孔者2只眼, 后极部裂孔者2只眼, 巨大裂孔者7只眼, 黄斑裂孔伴周边裂孔者2只眼; 牵拉性视网膜脱离者中均为糖尿病患者, 玻璃体机化条索所致者2只眼, 视网膜前膜形成者2只眼, 视网膜下膜形成者1只眼; 渗出性视网膜脱离者中1只眼为铁屑症, 1只眼为白内障术后脉络膜脱离型视网膜脱离; 牵拉裂孔性视网膜脱离者中眼外伤者6只眼, 其他增殖性玻璃体视网膜病变者2只眼。
手术方法
70只眼中, 最小量巩膜外垫压(不放液、不冷冻)者6只眼, 巩膜外垫压+巩膜外冷冻+放液者2只眼, 环扎+巩膜外垫压1只眼, 巩膜缩短+玻璃体切割+7% C3F8气体充填2只眼, 玻璃体切割+剥膜+硅油充填+环扎者3只眼, 玻璃体切割+剥膜+硅油充填者8只眼, 玻璃体切割+剥膜+眼内激光+硅油充填者45只眼, 硅油取出+玻璃体切割+剥膜+激光+硅油充填者2只眼, 硅油取出+玻璃体切割+剥膜+激光+硅油充填+环扎者1只眼。随访2~14个月, 平均(5.3±2.2)个月。
统计学处理
使用PEMS3.1软件包, 采用卡方检验法对治疗前后视力变化进行统计学分析, P < 0.05表示差异有统计学意义。
结果
术后视网膜复位情况
视网膜脱离患者68例70只眼中, 一次手术复位62只眼(其中19只眼硅油填充下视网膜在位), 二次手术复位5只眼, 三次手术复位1只眼; 一次手术未复位者中2只眼因外伤后360°锯齿缘离断, 视网膜卷缩成团, 部分视网膜缺失再加术中切除部分视网膜, 仅保留后极部少许视网膜, 故术中视网膜复位不满意, 未再采取手术, 硅油下支撑眼球。1只眼黄斑裂孔视网膜脱离1个月后手术, 给予玻璃体切割+巩膜缩短+气体填充, 术后第7天视网膜再次脱离, 故未复位, 二次给予硅油填充后视网膜复位, 黄斑裂孔愈合; 2只眼巨大裂孔视网膜脱离者行玻璃体切割+眼内激光+硅油填充术后硅油下视网膜脱离, 二次给予巩膜外环扎, 1例视网膜复位良好, 另1例仍不能复位者给予硅油置换联合巩膜外垫压后视网膜复位良好; 1只眼孔源性视网膜脱离行巩膜外冷冻+局部垫压后视网膜未复位, 给予玻璃体切割+硅油填充后视网膜复位良好; 2只眼玻璃体切割+眼内激光+硅油填充术, 3个月后硅油下视网膜脱离, 给予置换硅油后视网膜复位良好。
手术后视力
手术后最佳矫正视力包括无光感1只眼, 手动1只眼, 数指2只眼, 0.02~0.05者8只眼, 0.05~0.1者32只眼, 0.1~0.3者15只眼, 0.3以上者11只眼, 与术前比较差异有统计学意义(χ2=58.26, P= 0.000)(图 1)。
手术后并发症
进行巩膜外环扎的1只眼术后1周出现疼痛, 经过口服止痛药, 1周后疼痛逐渐缓解至消失。3只眼手术后视网膜前局限性增生, 2只为手术中视网膜部分切除者; 1只为糖尿病视网膜病变患者, 但未见视网膜脱离。5只眼并发白内障, 均为硅油眼内存留时间超过半年。8只眼出现一过性术后高眼压, 均为硅油填充术后1周内。余患者均无并发症发生。
讨论
手术治疗视网膜脱离的目的是解除玻璃体视网膜牵拉和封闭视网膜撕裂和裂孔。巩膜扣带术的视网膜复位率可达90%[2]。对于孔源性视网膜脱离范围小于CA2、玻璃体透明者局部巩膜外垫压术是比较理想的手术方法[3]。也有学者认为巩膜扣带术可能是黄斑裂孔发生的危险因素[4]。本组行巩膜扣带术者共9只眼, 包括最小量巩膜外垫压(不放液、不冷冻)者6只眼, 巩膜外垫压+巩膜外冷冻+放液者2只眼, 环扎+巩膜外垫压1只眼。未复位者有1只眼(11.1%), 有效率为88.9%。玻璃体切割手术的视网膜复位率可达75% ~90%[5]。本组单纯玻璃体切割类手术者55只眼, 其中6只眼(10.9%)一次手术视网膜未复位, 一次手术视网膜复位率为89.1%。还有6只眼行玻璃体切割类手术联合巩膜扣带术, 1只眼一次手术未复位。70只手术眼中62只眼一次手术视网膜复位成功, 总有效率为88.6%。
视网膜脱离手术失败约占5% ~10%, 主要是手术后数周内视网膜表面出现瘢痕组织, 包括血细胞、纤维以及炎症细胞等, 还有视网膜胶质细胞和色素上皮细胞经视网膜裂孔进入玻璃体腔内[5]。瘢痕组织向内收缩导致视网膜再脱离, 60% ~90%的此类患者需要再次手术, 其视功能恢复是非常差的[5]。本组中8只眼一次手术未复位, 6只眼采取了再次手术, 其中5只眼二次手术后视网膜成功复位, 1只眼行第三次手术。第一次手术失败后再次手术者占到75.0%。
对于视网膜脱离的治疗, 及时的手术将是恢复视功能的最佳手段[6]。虽然诊断和治疗技术在不断进步, 视网膜脱离复位后视力大于或等于20/50者仅占40%。术前视力的好坏直接影响视网膜复位率及术后视力的恢复状况。此外, 影响术后视力的因素还包括患者年龄、视网膜脱离时间、黄斑是否受累等[6]。本组研究中术后视力大于0.1者占视网膜复位成功者的26.5%, 远低于视力20/50者达40%的比例。可能与本组患者术前视力过低(大多数为眼前数指)、视网膜脱离时间过长(病程长者半年, 中位病程21d)以及黄斑区受累等原因有关。本组中因黄斑孔源性视网膜脱离者占到约1/5, 可能是影响术后视力的另一重要因素。有报道视网膜复位后视功能的恢复可能会持续到术后很长一段时间(43.5个月或长达5年)[5]。本组随访时间较短, 仅2~14个月, 还有部分眼仍在硅油填充下, 术后视力可能未达到最佳状态, 也是影响最终统计结果的另一个因素。对于高度近视黄斑裂孔致视网膜脱离者, Lee[7]主张进行两次手术, 第一次玻璃体切割, 填入硅油, 第二次取硅油联合剥膜术。本组还有部分眼仍在硅油填充下, 第二步手术未实施, 也是影响视力的重要因素。
视网膜脱离复位术的并发症包括巩膜扣带手术特有的并发症和玻璃体切割手术特有的并发症, 表现为感染、角膜直觉减退、角膜变性、白内障、青光眼、脉络膜脱离、增殖性玻璃体视网膜病变、黄斑水肿、斜视、持续的眼痛不适等[8]。本组主要的并发症为增殖性玻璃体视网膜病变、眼痛、白内障及高眼压等, 未出现巩膜扣带物排斥、感染、眼内炎、脉络膜脱离、斜视等并发症
视网膜脱离手术在发展中国家视网膜解剖复位率为80%, 近40%术后视力低于0.1[9]。本组到目前为止26只眼仍为硅油眼, 均超过2个月。所有70只眼中2只眼视网膜不能复位, 已放弃进一步治疗, 其他68只眼经1~3次手术后视网膜均已复位, 最终视网膜复位率达到97.1%, 但最佳矫正视力高于0.1者仅占37.1%。远低于发达国家或发展中国家的统计水平, 可能与术后观察时间过短有关, 最终的恢复情况有待进一步随诊观察。
综上, 视网膜脱离及时复位手术是非常重要的。虽有报道孔源性视网膜脱离存在自发复位的现象[10], 也不能消极等待到病情恶化后再采取措施。需逐步积累临床实践经验和关注理论上的突破, 根据视网膜脱离的类型、程度、时间确定科学的治疗方案。不但要确保视网膜解剖复位, 更需关注视功能的恢复。
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图 1 let-7a mimics对两种肝癌细胞的增殖、细胞周期和凋亡的影响
A.肝癌细胞MTT生长曲线分析；B.let-7a mimics对肝癌细胞周期的影响
let-7a: let-7a mimics治疗组；NC-Ctrl:阴性对照组![]()
图 2 let-7a mimics对裸鼠皮下肝癌移植瘤的影响
A.裸鼠皮下移植瘤生长曲线；B.局部注射给药4周，移植瘤实验结束后移植瘤大小及其侵及皮肤溃疡情况；C.移植瘤组织病理学，蓝色箭头示坏死区，黄色箭头示细胞分裂象(HE染色)
let-7a、NC-Ctrl:同图 1 -
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