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Relationship between Insulin-like Growth Factor and Patients with Systemic Sclerosis
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摘要:目的 探讨胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)与系统性硬皮病(systemic sclerosis, SSc)的关系。方法 采集2010年至2011年北京协和医院皮肤科就诊的24例SSc患者血清, 其中弥漫型SSc 12例, 局限型SSc 12例; 另外采集12名健康对照者及6例系统性红斑狼疮患者血清, 通过ELISA法检测血清IGF系统各因子的表达, 并结合患者临床资料进行分析。结果 SSc患者血清IGF-Ⅰ和胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding protein, IGFBP)-3水平高于健康对照组[分别为(49.21±37.94) ng/ml vs.(15.54±9.07) ng/ml和(3.38±2.09) ng/ml vs.(1.00±0.83) ng/ml, P < 0.001], 且SSc患者血清IGF-Ⅰ与IGFBP-3水平呈正相关(r=0.883, P < 0.001)。血清IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平与患者年龄、病程、Rodnan皮肤评分不存在相关性。血清IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平在Scl-70抗体阳性与阴性SSc患者间及在肺间质纤维化与无肺间质纤维化SSc患者间差异均无统计学意义。SSc患者血清IGF-Ⅱ、IGFBP-5和IGFBP相关蛋白1(IGFBP-related protein 1, IGFBP-rP1)水平与健康对照组比较差异无统计学意义。结论 SSc患者血清IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平升高, IGF系统可能参与了SSc的发病机制。Abstract:Objective To analyze the role of insulin-like growth factor (IGF) in patients with systemic sclerosis (SSc) and explore the relationship between these cytokines and the clinical characteristics of SSc.Methods Serum samples were obtained from 24 SSc patients[12 patients with diffuse cutaneous SSc (dcSSc) and 12 patients with limited cutaneous SSc (lcSSc)], 12 healthy controls and 6 patients with systemic lupus erythematosus (SLE). The levels of circulating IGF-Ⅰ, IGF-Ⅱ, insulin-like growth factor binding protein (IGFBP)-3, IGFBP-5, IGFBP-related protein 1 (IGFBP-rP1), and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) were measured with ELISA kits.Results The mean serum IGF-Ⅰ and IGFBP-3 levels were significantly higher in SSc patients than in healthy controls[(49.21±37.94) ng/ml vs. (15.54±9.07) ng/ml; (3.38±2.09) ng/ml vs. (1.00±0.83) ng/ml, both P < 0.001]. A positive correlation between serum IGF-Ⅰ and IGFBP-3 levels was found (r=0.883, P < 0.001). Serum IGF-Ⅰ and IGFBP-3 levels were not associated with age, disease course, and the modified Rodnan total skin thickness score. There were no significant differences in serum IGF-Ⅰ and IGFBP-3 levels between patients with Scl-70 antibody and patients without Scl-70 antibody. Also, the serum IGF-Ⅰ and IGFBP-3 levels showed no significant difference between patients with pulmonary interstitial fibrosis and patients without pulmonary interstitial fibrosis. There were no significant differences in serum IGF-Ⅱ, IGFBP-5, and IGFBP-rP1 levels between patients with SSc and healthy controls.Conclusion Serum IGF-Ⅰ and IGFBP-3 levels increase in SSc patients. IGF may play a role in pathogenesis of SSc.
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Keywords:
- insulin-like growth factor /
- systemic sclerosis /
- fibrosis
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硬皮病根据其临床表现、是否有内脏损害、皮肤硬化程度及其预后等分为局限性硬皮病及系统性硬皮病(systemic sclerosis，SSc)，SSc除皮肤硬化外，还同时伴有内脏器官纤维化，然而皮肤硬化是SSc的主要临床表现，皮肤硬化主要由真皮内以Ⅰ型胶原为主的细胞外基质过度沉积所致。硬皮病的发病机制尚未完全明确，目前认为炎症、自身免疫和血管损害可能导致成纤维细胞活化，而多种细胞因子可参与成纤维细胞活化和细胞外基质沉积[1]。胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)是体内重要的生长因子和促有丝分裂原，能够促进细胞增殖、分化和成熟，并抑制细胞凋亡[2-3]。IGF不仅在生长发育、代谢性疾病、恶性肿瘤等疾病中起重要作用，还可刺激成纤维细胞增殖，增加前胶原Ⅰ的mRNA水平，从而参与多种纤维化疾病的发生发展[4-5]。IGF家族由2个配体(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ)、2个受体[IGF-Ⅰ受体(IGF-Ⅰ receptor，IGF-ⅠR)和IGF-Ⅱ受体(IGF-Ⅱ receptor，IGF-ⅡR)]及至少6种高亲和力的胰岛素样生长因子结合蛋白(insulinlike growth factor binding protein，IGFBP) 1 ~ 6所组成。此外，IGFBP相关蛋白(IGFBP-related proteins，IGFBP-rPs)以及一组IGFBP蛋白酶也被归入IGF家族[6]。本研究通过对SSc患者血清IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGFBP-3、IGFBP-5、IGFBP-rP1和转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1，TGF-β1)的定量分析，探讨上述因子在SSc的表达及其与疾病严重程度的相关性。
对象和方法
对象
选取2010年至2011年北京协和医院皮肤科就诊的SSc患者24例(男性4例，女性20例)，所有患者诊断均符合美国风湿病协会(American Rheumatism Association，ARA)的分类标准，其中弥漫型系统性硬皮病(diffuse cutaneous scleroderma，dcSSc)12例，局限型系统性硬皮病(limited cutaneous scleroderma，lcSSc) 12例。患者年龄16 ~ 71岁，平均(40. 33 ± 12. 08)岁; 病程1 ~ 15年，平均(5. 08 ± 3. 86)年。随机选取健康对照者12名，其中男性2名，女性10名，年龄22 ~ 69岁，平均(42. 67 ± 13. 32)岁; 随机选取系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)患者6例，全部为女性，年龄23 ~ 46岁，平均(35. 67 ± 8. 35)岁。
主要试剂
人IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGFBP-3、IGFBP-5、IGFBPrP1和TGF-β1 ELISA试剂盒购自武汉华美生物公司。
方法
采集SSc患者、健康对照者及SLE患者的血清，使用促凝真空采血管(红头管)无菌静脉采血5 ml，室温放置2 h或4℃过夜后于1000 × g离心20 min，取上清分装于Eppendorf管，－ 80℃冻存。用ELISA试剂盒测定血清IGF各因子水平。
统计学处理
使用SPSS 17. 0软件包。正态分布变量数值以x±s表示; 使用Levene's test进行方差齐性检验; 两组正态分布变量比较采用独立样本t检验; 使用Mann-Whitney U检验对两组非正态分布独立变量进行秩和检验; 使用Spearman秩相关分析检验两连续非正态分布变量间的相关性。P＜0. 05表示差异有统计学意义。
结果
主要临床资料
24例SSc患者Rodnan皮肤硬度评分7 ~ 37分，平均(16. 40 ± 7. 70)分。所有患者血清抗核抗体(anti- nuclear antibody，ANA)检测均为阳性，滴度1:80 ~ 1:1280; Scl-70抗体阳性13例(54. 2%，13 /24)，抗着丝点抗体(anticentromere antibody，ACA)阳性1例(4. 2%，1 /24)。21例患者行肺部高分辨率CT，其中肺间质纤维化表现者14例。
血清IGF及TGF-β1水平比较
SSc患者血清IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平均高于健康对照组(P＜0. 001)，且dcSSc和lcSSc患者血清IGF-Ⅰ (P值分别为0. 002和0. 022)和IGFBP-3 (P值分别为0. 004和0. 001)水平也均高于健康对照组，但dcSSc与lcSSc两亚组间比较差异无统计学意义(P值分别为0. 612和0. 984)。另外，SSc患者血清IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平也均高于SLE组(P值分别为0. 045和0. 023);而健康对照组与SLE组比较差异无统计学意义(P值分别为0. 904和0. 517) (表 1)。
表 1 系统性硬皮病患者血清胰岛素样生长因子及转化生长因子-β1血清水平分组 n IGF-Ⅰ (ng /ml) IGF-Ⅱ (pg /ml) IGFBP-3 (ng /ml) IGFBP-5 (ng /ml) IGFBP-rP1 (ng /ml) TGF-β1 (ng /ml) 健康对照组 12 15. 54 ± 9. 07 548. 10 ± 350. 29 1. 00 ± 0. 83 87. 20 ± 25. 36 28. 20 ± 11. 01 5. 42 ± 0. 22 SLE 6 16. 07 ± 7. 78 1952. 37 ± 1887. 49 1. 26 ± 0. 71 71. 97 ± 29. 48 19. 44 ± 7. 70 5. 54 ± 0. 18 SSc 24 49. 21 ± 37. 94***† 383. 57 ± 302. 03 3. 38 ± 2. 09***† 109. 50 ± 45. 14 31. 33 ± 9. 06†† 7. 46 ± 0. 92***††† dcSSc 12 45. 15 ± 24. 64** 393. 51 ± 323. 78 3. 40 ± 2. 26** 106. 64 ± 25. 50 28. 94 ± 7. 98 7. 59 ± 1. 09*** lcSSc 12 53. 26 ± 48. 65* 373. 64 ± 292. 72 3. 38 ± 2. 02** 112. 37 ± 59. 93 33. 71 ± 9. 78 7. 33 ± 0. 74*** IGF:胰岛素样生长因子; IGFBP:胰岛素样生长因子结合蛋白; TGF-β1:转化生长因子-β1; IGFBP-rP: IGFBP相关蛋白; SLE:系统性红斑狼疮; SSc:系统性硬皮病; dcSSc:弥漫型系统性硬皮病; lcSSc局限型系统性硬皮病; 与健康对照组比较，* P＜0. 05，**P＜0. 01，***P＜0. 001;与SLE组比较，†P＜0. 05，††P＜0. 01，†††P＜0. 001 SSc患者血清TGF-β1水平高于健康对照组(P＜0. 001)，dcSSc与lcSSc患者血清TGF-β1水平亦均高于健康对照组(P＜0. 001)，但dcSSc与lcSSc组间比较差异无统计学意义(P = 0. 508) (表 1)。
SSc患者血清IGF-Ⅰ、IGFBP-3和TGF-β1水平相关性分析结果显示，SSc患者血清IGF-Ⅰ与IGFBP- 3水平呈正相关(r = 0. 883，P＜0. 001)，但TGF-β1与IGF-Ⅰ和IGFBP-3均无相关性(r = － 0. 019，P = 0. 904; r = － 0. 046，P = 0. 774)。
SSc患者与健康对照组血清IGF-Ⅱ、IGFBP-5和IGFBP-rP1水平比较，差异均无统计学意义(表 1)。
系统性硬皮病患者IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平与年龄及病程的相关性
SSc患者血清IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平与其年龄及病程的相关性分析结果显示，血清IGF-Ⅰ水平与年龄及病程无相关性(r = － 0. 043，P = 0. 841; r = － 0. 239，P = 0. 260);血清IGFBP-3水平与年龄及病程亦无相关性(r = － 0. 031，P = 0. 822; r = － 0. 035，P = 0. 871)。考虑到病程与年龄可能相互影响，分别控制病程和年龄，进行偏相关分析，仍未见相关性。
系统性硬皮病患者Scl-70抗体与血清IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平的关系
Scl-70抗体阳性患者(n = 13)血清IGF-Ⅰ和IGFBP- 3水平分别为(44. 42 ± 27. 38)和(3. 65 ± 2. 58) ng /ml，与Scl-70抗体阴性患者(n = 11)的(54. 86 ± 48. 43)和(3. 07 ± 1. 38) ng /ml比较，差异均无统计学意义(P值分别为0. 514和0. 510)。
系统性硬皮病患者Rodnan皮肤评分与血清IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平的相关性
24例SSc患者Rodnan皮肤硬度评分与血清IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平的相关性分析结果，均未发现具有相关性(r = 0. 014，P = 0. 959; r = 0. 162，P = 0. 565)。
系统性硬皮病患者肺间质纤维化与血清IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平的关系
胸部高分辨率CT示肺间质纤维化患者(n = 14)血清IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平分别为(39. 47 ± 21. 95)和(3. 19 ± 2. 04) ng /ml，与无肺间质纤维化患者(n = 7)的(69. 72 ± 60. 57)和(3. 83 ± 2. 65) ng /ml比较，差异均无统计学意义(P值分别为0. 243和0. 547)。
讨论
IGF是一类与胰岛素呈高度同源性的多肽生长因子，是体内重要的生长因子和促有丝分裂原[3, 7]，可在多种组织中表达，在受体和结合蛋白的调节下，通过自分泌、旁分泌和内分泌的方式作用于靶器官，影响细胞的生长和分化[8]。IGFBPs是一组对IGF具有高亲和力的分泌蛋白，广泛存在于血液和组织液中，通过与IGF结合，可以延长IGF的半衰期，调节循环中游离IGF的量，并帮助IGF从血管向靶组织转运。其中，IGFBP-3是最主要的IGFBP，可结合75% ~ 90%的IGF-Ⅰ[9]。
以往对IGF的研究多集中在生长发育性疾病、恶性肿瘤、糖尿病等方面，近年来其在致纤维化中的作用越来越受到关注。有关研究发现IGF参与了特发性肺纤维化[4-5]、肾纤维化[10-11]和瘢痕等多种纤维化疾病的发生发展。本研究结果证实SSc患者血清IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平升高，与Hamaguchi等[12]研究相符合，提示IGF-Ⅰ和IGFBP-3在SSc的发病机制中具有重要作用。而且SSc患者血清IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平与SLE患者比较差异亦有统计学意义，提示这两种因子有可能成为SSc纤维化的血清标记物。
IGFBPs除了作为转运蛋白外，还可以在靶组织中调节IGF的活性。体外实验发现，随着细胞类型、处理方法和实验条件的不同，IGFBPs具有抑制或增强IGF功能的作用[13-14]。在促纤维化作用中，IGFBP- 3在细胞外基质可与胶原Ⅰ和纤连蛋白结合，避免被水解而得到积累[15-17]。由于IGFBP结合细胞外基质成分后，减弱了对IGF的亲和力，从而可使IGF生物活性增加，促进皮肤纤维化。本研究结果表明，SSc患者血清IGF-Ⅰ与IGFBP-3水平具有相关性，提示在SSc发病过程中，IGF-Ⅰ与IGFBP-3可能具有一定的联系，IGFBP-3可能通过前述的IGF依赖方式发挥其生物学功能; 但两者的相关性也可能是循环中IGF-Ⅰ与IGFBP-3结合所致。
本研究结果未显示血清IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平与Scl-70抗体、Rodnan皮肤硬度评分及肺间质纤维化等反映疾病严重程度指标间的明显联系，虽然SSc患者血清IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平升高，但本研究结果不支持其作为评估病情轻重程度的指标。
TGF-β1是最强的纤维化促进因子，在纤维化发生发展过程中发挥着核心作用。TGF-β1可上调及诱导血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)等多种细胞因子在组织中的表达水平，从而介导成纤维细胞的增殖反应。本研究结果也显示SSc患者血清TGF-β1水平升高。为了解TGF-β1与IGF-Ⅰ和IGFBP-3在SSc发病中的联系，本研究对其血清水平进行相关性分析，结果显示SSc患者血清IGF-Ⅰ和IGFBP-3水平升高与TGF-β1水平升高无相关性，提示IGF可能不依赖于TGF-β1的致纤维化作用，其详尽机制尚需进一步深入研究。
本研究结果显示，SSc患者血清IGF-Ⅱ、IGFBP-5、IGFBP-rP1水平与健康对照组比较差异无统计学意义，推测IGF在SSc发病机制中的作用可能主要通过IGF-Ⅰ和IGFBP-3所介导。对IGF与SSc相关性的研究还需进一步在各个局部器官组织中进行，以获得IGF参与SSc发病机制的更直接证据。
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表 1 系统性硬皮病患者血清胰岛素样生长因子及转化生长因子-β1血清水平
分组 n IGF-Ⅰ (ng /ml) IGF-Ⅱ (pg /ml) IGFBP-3 (ng /ml) IGFBP-5 (ng /ml) IGFBP-rP1 (ng /ml) TGF-β1 (ng /ml) 健康对照组 12 15. 54 ± 9. 07 548. 10 ± 350. 29 1. 00 ± 0. 83 87. 20 ± 25. 36 28. 20 ± 11. 01 5. 42 ± 0. 22 SLE 6 16. 07 ± 7. 78 1952. 37 ± 1887. 49 1. 26 ± 0. 71 71. 97 ± 29. 48 19. 44 ± 7. 70 5. 54 ± 0. 18 SSc 24 49. 21 ± 37. 94***† 383. 57 ± 302. 03 3. 38 ± 2. 09***† 109. 50 ± 45. 14 31. 33 ± 9. 06†† 7. 46 ± 0. 92***††† dcSSc 12 45. 15 ± 24. 64** 393. 51 ± 323. 78 3. 40 ± 2. 26** 106. 64 ± 25. 50 28. 94 ± 7. 98 7. 59 ± 1. 09*** lcSSc 12 53. 26 ± 48. 65* 373. 64 ± 292. 72 3. 38 ± 2. 02** 112. 37 ± 59. 93 33. 71 ± 9. 78 7. 33 ± 0. 74*** IGF:胰岛素样生长因子; IGFBP:胰岛素样生长因子结合蛋白; TGF-β1:转化生长因子-β1; IGFBP-rP: IGFBP相关蛋白; SLE:系统性红斑狼疮; SSc:系统性硬皮病; dcSSc:弥漫型系统性硬皮病; lcSSc局限型系统性硬皮病; 与健康对照组比较，* P＜0. 05，**P＜0. 01，***P＜0. 001;与SLE组比较，†P＜0. 05，††P＜0. 01，†††P＜0. 001 
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