鼓室内注射是内耳局部药物递送的主要途径之一, 可有效避免全身给药的副作用，常用于突发性耳聋、梅尼埃病和自身免疫性内耳疾病的治疗。通过该途径, 药物可经圆窗膜渗透进入耳蜗外淋巴液中，并扩散至整个内耳。鼓室内注射给药创伤小，可增强内耳药物递送的效率，但个体间疗效差异大，可能与不同个体间的圆窗膜渗透差异性有关。此外，由于药物经咽鼓管流失，常需多次重复注射给药，可能导致持续性鼓膜穿孔、中耳感染、组织增生等并发症^[1-2]。因此，近年来针对药物鼓室内注射给药的递送方法研究，特别是纳米载药系统的研发已成为该领域的热点。

温度响应水凝胶是一种鼓室内给药载体，低温下呈液态，生理温度下转变为半固态，其可附着于圆窗膜上，减少药物经咽鼓管的流失并延长在中耳的停留时间，最终达到内耳持续药物递送的目的^[3-4]。常用的温度响应水凝胶载体主要包括壳聚糖甘油磷酸、泊洛沙姆407和聚氨基酸等^[5]。Lajud等^[6]首先使用壳聚糖为载体构建纳米药物水凝胶复合递送系统，提高了药物递送效率，但壳聚糖的降解能力不佳。后续Kim等^[7]将泊洛沙姆407水凝胶与聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒相结合，构建纳米药物水凝胶递送系统，发现聚乳酸-羟基乙酸亲水性差、缺乏功能性。聚氨基酸温度响应水凝胶除拥有稳定的三维结构和较高的载药率外，还具有生物相容性好、性能易于调节和降解后产物安全无毒等优点^[8]，这为鼓室注射给药的研发提供了潜在解决方案。既往研究中使用聚氨基酸纳米颗粒装载顺铂，显示出与游离顺铂相当的体内抗肿瘤功效和更低的全身毒性^[9]。将聚氨基酸温度响应水凝胶与纳米颗粒相结合形成的聚氨基酸纳米水凝胶复合药物递送系统，不仅可延长药物停留时间，还可增加药物的稳定性，保护药物不被降解，有望进一步增强药物的内耳递送效率^[10]。本研究以聚氨基酸温度响应水凝胶(聚乙二醇-聚谷氨酸二乙二醇酯) 和聚氨基酸纳米颗粒(聚乙二醇-聚谷氨酸) 构建新型药物递送系统，负载地塞米松内耳给药，评价药物在内耳中的释放特性和分布特性，探究该复合药物递送系统在临床应用的可行性和有效性。

1.   材料与方法

1.1   实验动物与主要材料

本研究包含体外实验和体内实验2部分。(1) 体外实验: 地塞米松、花青素CY5.5-氨基荧光染料、Triton X-100、戊巴比妥钠购自德国默克公司; 鬼笔环肽购自美国赛默飞世尔科技有限公司; 4%组织细胞固定液、山羊血清和磷酸盐吐温缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司; 脱钙液购自上海麦克林生化科技股份有限公司; 苏木素和伊红染液购自武汉赛维尔科技有限公司; 荧光封片剂(含DAPI) 购自北京中杉金桥生物技术有限公司; 盐酸利多卡因购自吉林省华牧动物保健品有限公司; 聚氨基酸载药纳米颗粒和聚氨基酸温度响应水凝胶材料均由中国科学院长春应用化学研究所提供^[11]。(2) 体内实验: 48只健康雄性白色红目豚鼠由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，体质量250~300 g，耳廓反射均正常。将48只豚鼠随机均分为4组: A组(生理盐水对照组)、B组(温度响应水凝胶对照组)、C组(地塞米松注射液对照组)、D组(地塞米松纳米药物水凝胶实验组)。

本研究涉及动物实验，已获得中国人民解放军总医院第六医学中心动物实验伦理委员会审批(审批号: 2020-X16- 51)。

1.2   研究方法

1.2.1   体外实验

1.2.1.1   荧光标记的地塞米松纳米药物的制备

将聚乙二醇与聚谷氨酸和地塞米松在无水条件下溶于二甲基甲酰胺，通过山口酯化反应制备成负载地塞米松的纳米颗粒，然后利用地塞米松纳米药物上的羧基与荧光分子CY5.5-NH₂上的氨基反应，合成荧光标记的地塞米松纳米药物。

1.2.1.2   地塞米松纳米药物水凝胶的制备

将地塞米松纳米药物在低温下与聚氨基酸温度响应水凝胶水溶液相混合并搅拌均匀。将混合液置于体外室温环境下，即可获得地塞米松纳米药物水凝胶, 或直接将混合溶液注射入豚鼠耳内，亦可形成地塞米松纳米药物水凝胶。

1.2.1.3   聚氨基酸温度响应水凝胶凝胶化时间测定

将提前制备好的聚氨基酸温度响应水凝胶水溶液置于37℃水浴锅中，每隔10 s将装有溶液的小瓶取出倾倒，可观察到水溶液成胶状，直至倒置小瓶液体不再流动时，即为温度响应水凝胶凝胶化的时间。

1.2.2   体内实验

1.2.2.1   手术注射导入地塞米松纳米药物水凝胶

腹腔注射1%戊巴比妥对实验动物进行麻醉。手术全程置于加热垫上，以保持动物体温正常。消毒后在豚鼠耳廓后方注射1% 盐酸利多卡因进行局部麻醉，沿耳廓后方作一弧形切口，分离组织与肌肉，于听泡上钻一个直径约1 mm的孔洞以暴露圆窗龛。使用微量注射器将等量(100 mg) 生理盐水、空白水凝胶、地塞米松注射液或地塞米松纳米药物水凝胶分别注射至A、B、C、D 4组动物的圆窗龛，并使用4-0尼龙缝线缝合切口。

1.2.2.2   豚鼠行为学观察

为评价手术操作和地塞米松纳米药物水凝胶对豚鼠行为学的影响，手术过程中观察A组和D组豚鼠对手术的耐受情况，术后7 d内有无进食障碍、体质量减轻，并记录4组在术后7 d内是否出现摆头、躯体旋转、步态不稳等前庭功能刺激体征。

1.2.2.3   听性脑干反应测量

为观察手术操作和地塞米松纳米药物水凝胶对豚鼠正常听功能的影响，分别于术后第1天、3天、5天、7天(每次取3只豚鼠)，取4组豚鼠麻醉后置于加热垫上，记录电极置于豚鼠两耳耳轮脚连线中点的垂线上颅顶中央皮下，参考电极沿耳后沟中部向前扎入置于测试耳耳甲艇皮下，接地电极置于非测试耳耳甲艇皮下，确保电极电阻小于1 Ω。采用美国TDT公司的听觉电生理系统及配套的BioSigRP系统软件进行听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR) 测量，记录听力阈值。刺激声为经校准的click声和短纯音(4 kHz、8 kHz、16 kHz、24 kHz、32 kHz)，强度由90 dB SPL逐渐减至0 dB SPL，衰减间隔为10 dB SPL，接近听力阈值时调整为5 dB SPL。喇叭出声管口置于豚鼠外耳道口处，开放声场给声。

1.2.2.4   聚氨基酸温度响应水凝胶体内降解时间测定

为观察温度响应水凝胶的体内自然降解速度，于B组中耳腔注射水凝胶100 mg后第1天、3天、5天、7天，分别取B组3只豚鼠麻醉后断头，取出完整听泡于解剖显微镜观察水凝胶状态并检测其残留量。

1.2.2.5   组织学和病理学观察

为评价地塞米松纳米药物水凝胶对内耳组织的安全性，术后第7天，取A组和D组豚鼠各3只麻醉后断头，取出耳蜗首先进行组织学观察(有/无膜穿孔、中耳腔感染流脓等不良反应)，然后进行病理学检查，以评价细胞毒性。方法如下: 采用4%组织细胞固定液进行灌流固定，脱钙7 d后包埋于石蜡中, 连续4 μm切片，进行苏木素和伊红染色，然后光学显微镜下观察组织和螺旋神经节细胞形态。

1.2.2.6   免疫荧光染色

为观察地塞米松纳米药物水凝胶进入内耳的空间分布规律，在术后第1天(内耳药物浓度最高峰时)，取D组豚鼠3只麻醉后断头，取出听泡并于解剖显微镜下打开，采用4%组织细胞固定液进行灌流固定。脱钙后，在磷酸盐缓冲液中分离基底膜底回、第2回、第3回、顶回，及椭圆囊和外半规管壶腹嵴。将标本移至0.1% Triton X- 100中通透30 min, 10%山羊血清封闭，1 h后加入适量鬼笔环肽，常温避光孵育1 h，磷酸盐吐温缓冲液清洗3次。将标本转移至载玻片上，滴入含DAPI的封片剂，轻轻盖上盖玻片，使用共聚焦显微镜观察基底膜各回处，及椭圆囊和外半规管壶腹嵴上的药物分布情况。

1.2.2.7   毛细胞计数

在组织病理学观察的基础上，为进一步评价地塞米松纳米药物水凝胶对耳蜗和前庭毛细胞的细胞毒性。术后第7天，取A组和D组豚鼠各3只，使用共聚焦显微镜进行耳蜗和前庭毛细胞计数。对于耳蜗内外毛细胞计数，在耳蜗基底膜底回、第2回、第3回及顶回处，以40倍放大倍数计算每个视野中内外毛细胞丢失百分比(每个视野中丢失的内外毛细胞数量/视野中内外毛细胞总数× 100%); 对于前庭毛细胞计数，在椭圆囊斑微纹区、微纹区内区域、微纹区外区域分别使用63倍物镜拍摄，以每10 000 μm²中毛细胞数目均值作为该区域的毛细胞密度。

1.2.2.8   药代动力学研究

为比较地塞米松纳米药物水凝胶与传统鼓室注射给药方法在内耳药物递送效率上的差异及其随时间变化的特点，分别于术后第1天、3天、5天、7天(每次取3只豚鼠)，取C组和D组豚鼠麻醉后断头, 取出听泡并清洗干净，于- 20℃冰箱保存。取加入12.5 μL氢氧化钠的离心管，分别加入100 μL标准曲线样品/质控样品/未知耳蜗匀浆液样品，涡旋静置后加入12.5 μL盐酸，再次涡旋后加入280 μL沉淀剂，最后涡旋并离心。取上清液进样，采用液相色谱-串联质谱法检测地塞米松药物浓度。

1.3   统计学处理

采用SPSS 24.0软件进行统计学分析。对于符合正态分布的计量资料(地塞米松药物浓度、听力阈值、耳蜗和前庭毛细胞计数)，以均数±标准差表示; 组间比较采用独立样本t检验或重复测量方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   聚氨基酸温度响应水凝胶凝胶化时间

温度响应水凝胶低温下呈液态(图 1A)，在37℃水浴锅中，随着时间延长，温度响应水凝胶逐渐由液态转变为固态，最终在80 s时，倾倒瓶中的液体不再流动(图 1B)。

图  1  不同时间下温度响应水凝胶的成胶状态

A.低温状态下；B.水浴锅中80 s

Figure  1.  Gel-forming states of temperature-responsive hydrogels at different times

A.at low temperature; B.in a water bath for 80 s

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2.2   聚氨基酸温度响应水凝胶体内降解时间

术后第1天、3天、5天、7天，聚氨基酸温度响应水凝胶残留量分别为53.57 mg (53.57%)、38.87 mg (38.87%)、13.57 mg (13.57%)、2.00 mg (2.00%)，提示该水凝胶在活体豚鼠耳腔内7 d基本可完全降解。

2.3   安全性研究

2.3.1   听性脑干反应

术后第1天、3天、5天、7天，4组豚鼠均进行ABR测试，各组平均听力阈值见图 2。术后第1天, B组和D组在16 kHz处的听力阈值有统计学差异(P＜0.05)，A组和B组在32 kHz处的听力阈值有统计学差异(P＜0.05)。其他刺激声下，4组不同时间点听力阈值均无明显差异(P均>0.05)。

图  2  4组术后不同时间点听力阈值

A.click声音下的听力阈值；B~F.4、8、16、24、32 kHz声音下的听力阈值
A组: 生理盐水对照组；B组: 温度响应水凝胶对照组；C组: 地塞米松注射液对照组；D组: 地塞米松纳米药物水凝胶实验组； ^*P<0.05 ABR (auditory brainstem response):听性脑干反应

Figure  2.  Hearing thresholds at different postoperative time points in the 4 groups

A.hearing thresholds at click sound; B to F.hearing thresholds at 4, 8, 16, 24, and 32 kHz sound
Group A: saline control group; Group B: temperature-responsive hydrogel control group; Group C: dexamethasone injection control group; Group D: dexamethasone nanomedicine hydrogel experimental group; ^*P<0.05

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2.3.2   组织学和病理学观察

术后第7天，组织学观察未见A组和D组出现鼓膜穿孔、中耳腔感染流脓等不良反应。苏木素-伊红染色示，与A组相比，D组耳蜗螺旋神经节细胞未见异常改变，细胞核无碎裂，耳蜗内未见纤维化和增生，无明显炎症反应(图 3)。

图  3  A组和D组术后第7天耳蜗组织苏木素-伊红染色(×25)

A.A 组; B.D 组
A组、D组: 同图 2

Figure  3.  Hematoxylin-eosin staining of cochlea on postoperative day 7 in groups A and D (×25)

A.group A; B.group D

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2.3.3   毛细胞计数

术后第7天时，A组仅耳蜗第2回存在微量外毛细胞丢失，而D组在耳蜗底回、第2回有微量外毛细胞丢失，但与A组均无统计学差异(P均> 0.05)。两组耳蜗内毛细胞均无丢失，且椭圆囊斑各区域前庭毛细胞密度均无统计学差异(P均>0.05)，见表 1、图 4。

表  1  耳蜗毛细胞丢失百分比(x±s, %)

Table  1.  Percentage of cochlear hair cell loss (x±s, %)

指标	外毛细胞			内毛细胞
	A组	D组		A组	D组
底回	0	0.42±0.73		0	0
第2回	0.89±0.78	0.44±0.76		0	0
第3回	0	0		0	0
顶回	0	0		0	0
A组、D组: 同图 2

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图  4  A组和D组前庭毛细胞密度比较

A.椭圆囊斑各区域示意图(红色代表Phalloidin染色标记毛细胞,蓝色代表DAPI染色标记细胞核)；B.前庭毛细胞密度统计图 A组、D组: 同图 2

Figure  4.  Comparison of vestibular hair cell density between groups A and D

A.diagram of utricular macula regions (red represents Phalloidin staining labeling hair cells, blue represents DAPI staining labeling cell nuclei); B.the statistical graph of vestibular hair cell density

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2.3.4   豚鼠行为学观察

A组和D组豚鼠术中均可耐受手术，术后无进食障碍，无体质量减轻。4组豚鼠术后7 d内均未出现摆头、躯体旋转、步态不稳等前庭功能刺激体征。

2.4   药物递送研究结果

2.4.1   药代动力学

术后第1天、3天、5天、7天，采用液相色谱- 串联质谱技术对C组和D组内耳中地塞米松的浓度进行检测，结果见图 5。术后第1天，C组内耳中地塞米松药物浓度高于D组，但差异无统计学意义(P=0.062); 术后3~5 d，C组地塞米松药物浓度出现显著下降，直至术后第7天降至不可检测范围。术后第7天时，C组地塞米松药物浓度显著低于D组, 差异具有统计学意义(P=0.005)，该过程显示了地塞米松在聚氨基酸纳米水凝胶内的持续释放情况。

图  5  C组和D两组术后不同时间点内耳中地塞米松药物浓度比较

^*P＜0.05 C组、D组: 同图 2

Figure  5.  Comparison of dexamethasone drug concentration in the inner ear at different postoperative time points in groups C and D

^*P＜0.05

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2.4.2   免疫荧光染色

术后第1天(内耳地塞米松药物浓度最高峰) 时, 取D组耳蜗和前庭组织进行免疫荧光染色(图 6), 以观察地塞米松纳米药物在内耳中的分布，结果显示药物主要见于耳蜗基底膜底回和第2回，其中以底回分布最多，顶回和第3回未见明显荧光，即无明显药物分布。

图  6  D组术后第1天时反映地塞米松纳米药物在内耳分布情况的免疫荧光染色图

红色代表CY5.5荧光标记的地塞米松纳米药物; 绿色代表Phalloidin染色标记毛细胞; 蓝色代表DAPI染色标记细胞核;
Merge代表 3种颜色荧光在同一张图片上显示
D组: 同图 2

Figure  6.  mmunofluorescence staining reflecting the distribution of dexamethasone nanomedicine in the inner ear at postoperative day 1 in group D

Red represents CY5.5 fluorescence labeling of dexamethasone nanomedicine; green represents Phalloidin staining labeling of hair cells; blue represents DAPI staining labeling of cell nuclei; Merge represents the three colors of fluorescence shown on the same image

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3.   讨论

本研究成功构建了可负载地塞米松内耳给药的聚氨基酸纳米水凝胶，经体外实验验证，其具有可注射性和良好的可降解性; 进一步体内实验表明该水凝胶无明显细胞毒性，是一种安全、有效的内耳药物递送系统。

近年来，聚氨基酸温度响应水凝胶因其优秀的生物相容性、生物降解性和类似于天然氨基酸和蛋白质的独特二级结构而备受青睐^[11]，通过封装各种生物活性剂、细胞或药物，聚氨基酸水凝胶可用于生物医学的不同平台^[12]。其中，基于聚谷氨酸的聚氨基酸水凝胶因其良好的安全性和理化特性成为近年来研究的热点之一，此种新型智能响应水凝胶可通过调节聚合物的聚合度、氨基酸种类和亲疏水性，对氨基酸的成胶温度进行调控^[13]。本研究所使用的聚氨基酸温度响应水凝胶(聚乙二醇-聚谷氨酸二乙二醇酯) 在低温下呈流动状态，具有良好的可注射性，而在37℃温度时80 s即可完成由溶液到凝胶的相变，此种特性为鼓室注射给药提供了全新的解决方案。此外，本研究采用的聚氨基酸温度响应水凝胶和聚氨基酸纳米颗粒(聚乙二醇-聚谷氨酸) 均具有良好的生物相容性，多项研究显示其降解产物多为中性、无毒的氨基酸衍生物^{[8, 14]}，为其临床应用奠定了基础。

采用温度响应水凝胶构建新型鼓室注射药物递送系统，要求水凝胶具备适宜的相变时间，不仅要满足鼓室注射操作所需的时间，且需尽可能缩短注射后药物由溶液相变为凝胶的时间。水凝胶的相变时间由材料的密度所决定。通过前期体外实验探索，笔者所在团队发现7%的水凝胶相变时间约为80 s，可满足鼓室注射给药临床应用的需要。另一方面，水凝胶的降解时间也对其临床应用至关重要。适当减慢降解速度可延长中耳给药时间，但过慢的降解速度具有诱发分泌性中耳炎的风险，而降解速度过快可导致药物过早从咽鼓管流失，降低了给药效率。降解速度与共聚物的拓扑结构相关。笔者所在团队在与中国科学院长春应用化学研究所的前期合作中，对材料拓扑结构进行了优化，通过测试不同拓扑结构的聚合物，获得了可在中耳腔1周内降解的温度响应水凝胶材料。

糖皮质激素在突发性耳聋和梅尼埃病等内耳疾病治疗中的作用已得到广泛认可^[15-16]。研究表明, 豚鼠内耳分布大量地塞米松的受体，如螺旋韧带、螺旋器、螺旋神经节及前庭的感觉上皮组织，这些部位为地塞米松在内耳的作用靶点。糖皮质激素在内耳中的作用可能包括代谢作用、离子转运、神经活动的调节，及免疫和炎症反应的弱化^[17]。然而, 采用糖皮质激素治疗内耳疾病时，通常需多次给药以达到满意的治疗效果^[18]，而反复注射则增加并发症发生率。本研究将聚氨基酸水凝胶和载药纳米颗粒的特性相结合: 水凝胶减少咽鼓管清除率并延长药物在中耳的停留时间，载药纳米颗粒可增强药物稳定性及其通过圆窗膜的渗透性^[7]，此种新型复合纳米药物递送系统的构建方法，已在药物递送、基因治疗和生物成像等多个生物医学研究领域中广泛应用^[10]。

在给药系统构建完成后，需通过动物实验评价其细胞毒性和安全性。结果显示，将纳米药物水凝胶注射入豚鼠鼓室7 d后，苏木素-伊红染色示螺旋神经节细胞未见异常改变，且未观察到明显的炎症反应。毛细胞计数显示，与A组相比，D组耳蜗和前庭毛细胞均无明显减少，提示该纳米药物水凝胶无明显的内耳细胞毒性。为进一步验证该聚氨基酸纳米水凝胶的安全性，本研究通过ABR测试对比了4组豚鼠术后听力情况，结果表明在注射水凝胶后第1天，B组在16 kHz处的平均听力阈值高于D组，B组在32 kHz处的平均听力阈值高于A，且差异具有统计学意义。暂时性的听力损失可能是由于水凝胶进入中耳腔影响声音传导所导致，这与既往使用其他水凝胶的研究结果相一致^[19-20]。随着聚氨基酸纳米水凝胶在注射7 d后几乎完全降解，听力得到完全恢复。上述结果结合豚鼠行为学观察表明，该聚氨基酸纳米水凝胶具有较好的生物可降解性和安全性。

药代动力学结果表明，术后第1天时，地塞米松纳米药物水凝胶表现出了延迟释放效应。术后第7天时，C组地塞米松药物浓度已降低至不可检测水平, 而D组耳蜗中仍可检测到显著的地塞米松药物浓度, 提示该聚氨基酸纳米水凝胶可有效延缓药物释放，延长药物作用时间。免疫荧光染色结果显示，地塞米松纳米药物水凝胶经鼓室注射1 d后，地塞米松在耳蜗及前庭器官中均有明显分布，显示其较好的内耳药物递送能力。其中，地塞米松在耳蜗底回和第2回的浓度比耳蜗第3回和顶回更高，这与其他鼓室注射给药的研究报告结果相似^[21]。

本研究局限性: (1) 由于豚鼠与人类在生理结构和药物代谢等方面存在差异，使用豚鼠构建实验模型无法完全模拟人类的生理特征，可能影响结果的临床转化; (2) 虽然评估了药物在内耳中的分布情况, 但缺乏定量分析; (3) 未评估水凝胶的长期疗效和安全性。

综上，利用聚氨基酸纳米水凝胶递送系统，通过单次鼓室注射，可实现地塞米松的持续内耳给药，且药物可有效进入耳蜗和前庭等部位。此种新型药物递送系统具有良好的可注射性、生物可降解性、生物安全性和持续药物递送能力，可减少鼓室注射次数，降低不良反应，并提供更为持久的内耳药物浓度，为未来负载糖皮质激素进行梅尼埃病和突发性耳聋等内耳疾病的治疗奠定基础，具有良好的临床应用前景。