海拔3000 m以上的高原地区具有独特的气候特征，包括高海拔、明显的气温波动和强烈的太阳辐射，可在多方面对人类生活产生影响^[1]。急进高原的人群和长期生活在此地区的居民在生理和结构上均会发生特异性变化，以适应高原地区独特的环境特征^[2]。生殖系统是维持种群延续的关键组分，其功能正常对于人类生存和繁衍至关重要。在复杂且精密的生殖系统中，睾丸支持细胞可为生殖细胞稳定进行有丝分裂和减数分裂提供支持框架，在精子产生和成熟过程中扮演关键角色^[3]，但其功能常受外界环境因素的干扰^[4-5]，继而影响生殖系统功能^[6]，如高海拔或血液供应异常将导致环境缺氧^[7]，进而影响支持细胞与精子的通讯信号，以致男性生育能力下降，表现为精液参数异常和生殖激素水平紊乱^[8]。动物实验证实，高海拔环境对大鼠精子生成、睾丸功能、勃起能力和后代繁殖能力均具有不利影响^[9]，且临床研究表明从事高海拔活动可损害男性生殖参数^[10]。既往在低压低氧诱导的动物模型中发现，睾丸内极度缺氧可促进支持细胞呈脂滴改变和高度空泡化，以致与生殖细胞间隙的连接被破坏，出现精子数量减少的现象^[11]。由于细胞通讯涉及一系列信号分子、受体和通路，目前低压低氧环境发挥生殖功能调控的详细机制尚不明确。本文旨在探究低压低氧环境对生殖系统睾丸支持细胞与精子形成过程中细胞通讯的影响，重点分析低压低氧环境对支持细胞的干扰情况，进而探究其影响精子生成机制，以期为在高海拔地区等缺氧条件下保护精子功能提供新思路。

1.   材料与方法

1.1   实验动物与分组

4周龄健康雄性小鼠20只，体质量为17~25 g，动物合格证号为IACUC-20221212。所有小鼠均在12 h光照周期下饲养，可自由获取食物(标准食物)和水。适应性饲养一段时间后，采用随机数字表法将小鼠分为对照组和低压低氧组各10只。其中低压低氧组暴露于低压缺氧环境(压强=14 kPa，氧含量=14.5%)，以模拟高海拔环境；对照组于正常环境下饲养。

本研究已通过空军军医大学动物中心伦理审查(审批号：陕动管字第2913号)，并按照《国家实验动物保育和使用准则》执行。

1.2   研究方法

1.2.1   样本采集与处理

6周后，两组均随机选取3只小鼠，获取睾丸组织后采用PBS液(pH=7.4)洗涤3次，然后储存于GEXSCOPE^TM组织保藏液中以备光镜下观察睾丸细胞形态。

1.2.2   免疫荧光染色与Western Blot蛋白定量分析

两组另各取2只小鼠的睾丸组织，采用4%甲醛固定液固定24 h，依次经脱水、渗透、浸蜡和包埋处理后，连续4 μm切片。采用武汉塞维尔生物科技有限公司生产的PSPAP(GB11364，1∶1000)、GPR37(GB111220，1∶1000)、DAPI(G1012，1∶1000)抗体进行细胞免疫荧光染色和细胞核染色。两组另各取2只小鼠的睾丸组织，置于含蛋白酶抑制剂混合物(美国Sigma公司)的放射免疫共沉淀浸润缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司)中裂解30 min。采用超敏感ECL化学发光检测试剂盒(ZD310A，ZOMABIO)进行蛋白检测，并采用ImageJ软件进行定量分析。

1.2.3   Singleron Matrix^TM单细胞RNA测序

两组另各取3只小鼠的新鲜睾丸组织，30 min内制备单细胞悬液(10⁵个细胞/mL)并加载至微流控装置中。参照Singleron GEXSCOPE^®协议(Singleron Biotechnologies)，采用GEXSCOPE^®单细胞RNA文库试剂盒构建单细胞RNA测序文库。将文库稀释(4 nm)、混合后于美国Illumina NovaSeq平台进行150 bp双端读取睾丸组织单细胞RNA测序。

1.2.4   测序数据处理与分析

采用FastQC和MultiQC软件评估测序reads质量，并生成样本单细胞基因表达矩阵，矩阵中包含与每个细胞条形码相关基因的独特分子标签(unique molecular identifier，UMI)；采用UMAP程序包进行细胞聚类分析；采用Seurat软件包中的FindMarkers功能基通过Wilcox似然比检验以识别差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)；采用clusterProfiler程序包进行GO和KEGG富集分析；基于SynEcoSys^TM参考数据库(Singleron Biotechnology)中经典标志物表达情况确定每个细胞簇中的细胞类型；采用Monocle2程序包重新构建单核细胞亚群拟时序轨迹分析图；采用pySCENIC 0.11.0、scRNA表达矩阵和AnimalTFDB中的转录因子构建转录因子网络^[12]；利用CellPhoneDB软件进行细胞通讯分析。

1.3   统计学处理

采用R 4.0.5和Python 2.7.5软件进行统计学分析。组间和细胞类型间DEGs鉴定及各蛋白组间比较采用Wilcoxon秩和检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   低压低氧环境暴露下睾丸细胞类型鉴定及聚类分析

成功构建睾丸组织单细胞转录组图谱，其共包含对照组与低压低氧组各3个样本。睾丸细胞类型大类UMAP分析表明，低压低氧组与对照组存在显著异质性，各组聚类分析显示两组内所有睾丸样本均表现出良好重复性。采用UMAP程序包对49 027个睾丸细胞进行聚类分析，共确定11个细胞簇(图 1A)，各类型细胞簇标记基因的表达情况见图 1B，各样本的UMAP图谱见图 1C。为进一步确定各细胞簇的细胞类型，选取不同类型睾丸细胞的标记基因，包括管周肌样细胞、支持细胞、间质细胞、巨噬细胞4种类型体细胞，以及精原细胞、精子细胞2种类型雄性生殖细胞聚类UMAP图进行细胞比例计算与可视化分析，结果显示，相较于对照组，低压低氧组支持细胞和生殖细胞数量发生明显变化，生殖细胞整体数量减少，其中以精原细胞减少为著，而长型精子细胞、环形精子细胞数量显著增加，见表 1。

图  1  睾丸细胞类型鉴定和聚类分析

A.睾丸单细胞UMAP图谱；B.各类型细胞的细胞标记气泡图；C.各样本的UMAP图谱

Figure  1.  Identification and clustering analysis of testicular cell types

A.UMAP plot of testicular single cells; B.Bubble plot of cell markers for each cell type; C.UMAP plots of each sample

下载: 全尺寸图片 幻灯片

表  1  不同类型睾丸细胞占比[n(%)]

Table  1.  Proportion of different types of testicular cells [n(%)]

细胞类型	对照组(n=22 505)	低压低氧组(n=26 522)
内皮细胞	144(0.64)	15(0.06)
长型精子细胞	4045(17.97)	1 0939(41.25)
成纤维细胞	629(2.79)	116(0.44)
间质细胞	40(0.18)	94(0.35)
巨噬细胞	357(1.59)	432(1.63)
管周肌样细胞	389(1.73)	1(0.00)
环形精子细胞	1288(5.72)	5739(21.64)
支持细胞	528(2.35)	586(2.21)
精母细胞	7710(34.26)	7044(26.56)
精原细胞	6927(30.78)	1251(4.72)
T细胞和NK细胞	448(1.99)	305(1.55)

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.2   低压低氧环境暴露下支持细胞亚群聚类及细胞周期分析

为详细评估支持细胞的内部异质性，对检出的1114个支持细胞进行分析。首先采用非负矩阵分解(non-negative matrix factorization，NMF)算法对高变异基因矩阵进行分解，然后将结果导入Seurat进行聚类分析并最终得到4个细胞亚群(图 2A~2C)。条形占比图示(图 2B)，低压低氧组亚群1的占比下降(P=0.001)，亚群2的占比升高(P=0.033)。为进一步分析支持细胞在低压低氧环境中的变化特征，对细胞周期进行检测后发现，低压低氧组G2M期细胞的比例显著增多(图 2D)。在对长型精子细胞和精原细胞的细胞周期分析中得到一致结果，即低压低氧环境暴露后多数细胞处于G2M期。在细胞周期蛋白表达方面，低压低氧组睾丸组织中Cyclin A1、CDK2、Cyclin E1、CDK1、Cyclin B1表达量明显降低(图 2E、2F)。提示低压低氧刺激可诱导支持细胞的细胞周期发生变化，从而导致生殖细胞的细胞周期停滞。

图  2  单细胞转录组亚群聚类与细胞周期分析

A.UMAP可视化对支持细胞亚群细胞团的注释；B.条形图显示各细胞亚群占比的条形图；C.小提琴曲线图表示每个细胞团选定的标记基因，颜色表示每种细胞类型的标记基因；D.条形图显示处于不同细胞周期阶段的细胞百分比；E.低压低氧暴露后睾丸细胞周期蛋白Cyclin A1、CDK2、Cyclin E1、CDK1、Cyclin B1表达显著降低；F.蛋白定量分析结果; ^#P＜0.01，^*P＜0.05

Figure  2.  Single-cell transcriptomic subpopulation clustering and cell cycle analysis

A.UMAP visualization annotating supportive cell subpopulations clusters; B.Bar plot displaying the proportions of each cell subpopulation; C.Violin plot representing selected marker genes for each cell cluster, with colors indicating marker genes for each cell type; D.Bar plot showing the percentages of cells in different cell cycle stages; E.Testicular cell cycle proteins Cyclin A1, CDK2, Cyclin E1, CDK1, Cyclin B1 exhibited significantly decreased expression after exposure to low pressure and hypoxia; F.Results of protein quantification analysis; ^#P < 0.01, ^*P < 0.05

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   睾丸细胞中支持细胞亚群特征

为评估支持细胞的细胞周期变化与细胞亚群异质性的相关性，对不同亚群分化和相应基因表达情况构建拟时序轨迹分析图，共发现3种新的状态(图 3A、3B)。亚群2主要聚集于轨迹的初始段，且多数处于发育起始端，而亚群1则位于支持细胞发育的中后期(图 3C)。亚群2主要分布于状态1和状态2，而亚群1、3、4则主要处于状态3(图 3D~3F)。值得注意的是，低压低氧环境暴露后，状态3中支持细胞的数量及其比例显著降低，而状态1和状态2中支持细胞数量及其比例明显升高(图 3D)。为进一步区分状态1与轨迹1、状态3与轨迹2的基因调控关系，采用线条图对该2个分支的基因表达动力学进行展示(图 3G)，结果显示，在低压低氧环境暴露下，每个分支均具有高水平表达基因群，如ASRGL1、CRISP2、HSPB9、ROPN1L。其中CRISP2是一个富含半胱氨酸的分泌蛋白，在睾丸组织内呈高度富集状态，并特异性分布于精子顶体、精子尾部的附属结构及生精上皮内胚芽细胞与支持细胞的连接处，在血睾屏障的维持中起重要作用^[11]。HSPB9在生殖细胞发育和精子中高度表达，早期过表达可表现为促细胞凋亡的作用，但随着表达量增加，其抑制细胞凋亡的作用逐渐增强。当细胞受热应激刺激时，HSPB9表达水平高于HSPB1和HSPA2，并向此2种蛋白提供负反馈信号，以减少早期细胞凋亡，促进细胞存活^[12]。在线条图中，ASRGL1、CRISP2、HSPB9和ROPN1L等与精子发育密切相关及对异生素具有反应的基因在低压低氧暴露后表达量显著提高。选定相关基因后重新构建拟时序分析轨迹，以便对随着亚群转变而发生表达变化的基因进行鉴定(图 3H)。GO富集分析显示，状态1中上调的基因与异生素的刺激相关，包括FABP9、ROPN1L、ODF2、CFAP206、HSPA2和CFAP69。状态2则反映了在拟时序轨迹内由较低水平表达上调的基因，其在精子细胞发育、分化和精子运动中被富集。值得注意的是，与异生素刺激相关的基因在进入轨迹2时表达显著上调，而在轨迹1时则有所下调。

图  3  支持细胞亚群特征分析

A.通过拟时序轨迹分析图可视化支持细胞亚群轨迹分支；B.不同状态着色的支持细胞伪时间轨迹分析；C.不同细胞群着色的支持细胞拟时序轨迹分析；D.不同状态下的支持细胞数量；E.不同状态下支持细胞比例；F.不同状态的细胞成分分析；G.支持细胞种群中不同状态的代表性基因表达动态线条图；H.按拟时序轨迹分析时间线绘制来自不同支持细胞子集的差异表达基因热图

Figure  3.  Supporting feature analysis of cellular subpopulations

A.Visualization of supportive cell subpopulation trajectory branches through pseudo-temporal trajectory analysis plots; B.Pseudo-temporal trajectory analysis of supportive cells colored by different states; C.Pseudo-temporal trajectory analysis of supportive cells colored by different cell groups; D.Number of supportive cells in different states; E.Proportion of supportive cells in different states; F.Analysis of cell composition in different states; G.Dynamic line plots of representative gene expression in different states within the supportive cell population; H.Heatmap of differentially expressed genes from different subsets of supportive cells plotted along a timeline according to pseudo-temporal trajectory analysis

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   基于GO和KEGG富集分析揭示富含支持细胞亚群的途径

为探究支持细胞4个亚群的潜在功能，对DEGs进行GO和KEGG富集分析。在GO分析中(图 4A)，亚群1中分子功能(molecular function, MF)相关富集与细胞氧化磷酸化相关(FDR校正P值＜0.05)，表明该亚群可能参与ATP合成与分解；亚群2涉及纤毛运动、精子细胞分化和发育过程(FDR校正P值＜0.05)，可能在精子发育、成熟中发挥作用(图 4B)；亚群3与细胞色素P450介导的异物代谢途径、药物代谢途径、谷胱甘肽代谢途径以及化学致癌等途径相关(FDR校正P值＜0.05)，可能参与对有毒物质的反应(图 4C)；亚群4可能与转录辅助调节因子活性相关(FDR校正P值＜0.05)，涉及mRNA合成与加工过程(图 4D)。在KEGG分析中，亚群1与帕金森和神经退行性疾病通路相关(图 4E)；亚群2中，与卵母细胞减数分裂和细胞周期相关基因显著富集(图 4F)；亚群3中与异生素代谢相关的基因显著上调，表明低压低氧暴露可促进异生素代谢(图 4G)；亚群4中蛋白质处理、细胞凋亡与脂肪酸代谢富集显著(图 4H)。

图  4  支持细胞各亚群的GO和KEGG富集分析

A~D.亚群1~4 GO分析；E~H.亚群1~4 KEGG分析

Figure  4.  GO and KEGG enrichment analysis of cellular subpopulations

A-D.GO analysis of subgroups 1-4; E-H.KEGG analysis of subgroups 1-4

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.5   支持细胞成熟过程中的调控网络

假设在2个连续状态的交界处(轨迹1与轨迹2)，关键基因表达情况发生巨大变化。因此，笔者筛选了200个候选调节因子进行SCENIC分析，以确定支持细胞的关键调节因子(图 5)。在不同支持细胞亚群间转录因子差异分析中，亚群1共出现34种转录因子聚集，其中马达蛋白KIF16的权重最高。KIF16的异常表达或功能异常可能会导致细胞分裂异常，进而影响细胞生长和发育。在亚群2中，E4F1的权重最高，提示低压低氧可通过调节转录因子E4F1水平影响精子发育。进一步对E4F1的靶基因进行功能富集分析后发现，EIF3B为E4F1的靶基因，在E4F1下游发挥重要作用。亚群3中，调控作用最显著的转录因子为TFEB，其靶基因PRNP的权重为5.38。TFEB是溶酶体生物发生和自噬的主要转录调节因子^[13]。如前文所述，亚群3可能与异生素的调节反应相关，故推测低压低氧环境暴露可能通过激活TFEB，进而调节PRNP表达，以促进异生素代谢。亚群4中，处于核心地位的转录因子为MITF，其靶基因SRSF10的权重为5.16。研究证明，MITF可作为青鳉鱼生殖基因表达的转录激活剂，而SRSF10在神经和睾丸组织中呈高表达，对精子生成和男性生育能力至关重要^[14]。文献报道，敲除小鼠SRSF10基因将破坏正常生殖细胞的细胞周期和精子增殖^[15]。

图  5  低压低氧组支持细胞亚群SCENIC分析结果

Figure  5.  The SCENIC analysis results of subpopulations in the low pressure low oxygen group

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.6   单细胞转录组数据大类及支持细胞通讯分析

支持细胞在生殖细胞发育中发挥多方面作用，包括形成血睾屏障、执行分泌功能、吞噬管腔中残余的细胞和部分退化的生精细胞。细胞间通信通常稳定存在于配体-受体的相互作用中，而生殖细胞发育的关键组成部分是生殖细胞和周围细胞对睾丸微环境的调节。为进一步明确支持细胞在低压低氧环境暴露下对生精细胞的作用，通过CellPhoneDB软件对支持细胞与其他细胞的通讯关系进行分析，结果显示(图 6A)，相较于对照组，低压低氧组支持细胞与其他细胞之间的通讯信号有所增强，其中以支持细胞与间质细胞的通信连接增强最为显著，二者的通讯关系通过PSAP-GPR37相互作用得以增强(气泡图中其作用最为显著，且免疫荧光染色也证实上述现象，图 6B)。基于配体-受体相互作用数据库，进一步对细胞间通讯关系进行全面分析，结果显示(图 6C)，亚群4的支持细胞与各种精子细胞之间存在强烈关系，涉及超过15个相互作用对，并主要通过KITLG-KIT相互作用对调节精子细胞的状态。与之类似，亚群3与各类精子细胞之间的通信亦呈增强状态，并通过PTN-PTPR相互作用对调控各类精子细胞(图 6D)。如前文所述，亚群4可能与转录辅助调节因子活性相关，支持细胞亚群4可能通过产生多种可溶性因子，在精子形成与发育维持、精原干细胞库维护、精原干细胞自我更新及生殖细胞分化启动中起关键调控作用^[16]。亚群3的主要功能是根据外界环境变化作出相应反应，其与生殖细胞之间的通讯变化可能涉及调节细胞色素P450对异生素、谷胱甘肽、甘氨酸、丝氨酸及硫氨酸代谢。此外，亚群3还可调节低压低氧刺激所致的生殖细胞周期停滞，从而对生殖细胞产生保护作用。因此，推测低压低氧环境暴露可能通过影响亚群4支持细胞mRNA表达，以调节脂肪酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成及相关细胞因子水平，而下游细胞因子通过与精原干细胞或未分化的精原细胞的同源受体相结合，激活MAPK或PI3K-AKT途径干扰细胞周期，导致精子细胞的细胞周期停滞^[17]，故认为支持细胞亚群3和亚群4可能在低压低氧环境暴露下对生殖细胞相关功能的调控发挥核心作用。

图  6  睾丸各细胞的细胞相互作用分析

A.配体-受体相互作用网络示意图；B.配体-受体相互作用气泡图示在不同细胞类型中表达强度和特异性(睾丸冰冻切片为免疫荧光染色，×100 μm)；C.支持细胞亚群细胞通讯热图；D.支持细胞亚群与各精子细胞之间的相互作用对气泡图

Figure  6.  Cell-Cell interaction analysis of various testicular cells

A.Schematic diagram of ligand-receptor interaction network; B.Bubble plot of ligand-receptor interactions showing expression intensity and specificity in different cell types (testicular frozen sections immunofluorescently stained, scale=100 μm); C.Heatmap of cell communication within supportive cell subgroups; D.Bubble plot of interactions between supportive cell subgroups and various sperm cells

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论

支持细胞是精子生成过程中的关键组分，可为精子生成提供至关重要的生精微环境^[18]，以保障精子形成及发育过程的顺利进行，但支持细胞功能易受外界环境的影响，从而影响生殖细胞发育和机体生育能力。本研究首次证实，低压低氧环境暴露可改变睾丸基因表达，并对支持细胞的细胞周期和发育轨迹产生重要影响。首先，通过构建低压低氧环境下的睾丸组织单细胞转录组图谱，深入剖析了在此特殊环境下支持细胞和生殖细胞之间的复杂调控网络。低压低氧组显示支持细胞和生殖细胞数量发生明显变化，表现为生殖细胞整体数量显著减少，表明低压低氧环境可能对生殖细胞发育和维持产生重要影响。其次，NMF算法和Seurat聚类分析显示，支持细胞可分为4个亚群，且不同亚群在低压低氧环境中显示出不同的调控特征，尤其在细胞周期和转录因子表达方面具有诸多差异。其中亚群3和亚群4表现为对低压低氧环境较为敏感，可能在支持细胞功能方面发挥调节作用，并最终影响精子形成、发育和生殖细胞分化。再次，SCENIC分析揭示了在低压低氧暴露下支持细胞类型转变和关键调控因子的转录特征，其中E4F1在亚群2中的权重最高。文献表明，E4F1表达缺失可引起支持细胞数量减少、睾丸体积减小，并导致生精细胞凋亡增多^[19]。对于亚群3，其可通过激活TFEB进而调节PRNP表达，以促进异生素代谢，从而减轻缺氧对细胞的毒性作用。

最后，通过CellPhoneDB软件对支持细胞与其他细胞的通讯关系进行分析，结果发现低压低氧组中支持细胞与其他细胞之间的通讯信号有所增强，尤其以支持细胞与间质细胞之间的通信连接增强为著。此种增强的通讯信号可能通过多个相互作用对影响生殖细胞的发育和功能，在亚群3中，PTN-PTPR相互作用对在精母细胞的调节呈显著增强趋势。研究表明低氧可诱导PTN和PTPR表达^[20-21]，以调节生殖细胞的细胞周期。推测支持细胞亚群3可通过影响PTN表达水平、调控精母细胞的细胞周期，以减少低压低氧所引发的生殖细胞功能损伤，PTN-PTPR通路可能为支持细胞对精原细胞发挥调控作用的一个重要调控节点。在亚群4中，以KITLG-KIT相互作用对的效应最为明显。研究表明，KITLG具有多种生物学功能，可调控细胞增殖、迁移和凋亡^[22]，且KITLG和KIT基因多态性或突变与睾丸癌、睾丸功能障碍具有相关性^[23]。推测在机体暴露于低压低氧环境后，支持细胞亚群4可通过KITLG-KIT信号通路调控精原细胞的细胞周期，进而影响精子发育。

本研究通过构建睾丸组织单细胞转录组图谱，深入探究了低压低氧环境下支持细胞和生殖细胞之间的调控网络，并发现低压低氧环境可对支持细胞的细胞周期和发育轨迹产生重要影响。支持细胞被分为4个亚群，不同亚群在环境刺激下表现出不同的调控特征，尤其在细胞周期和转录因子表达方面变化较为显著。通讯信号分析显示，低压低氧环境可增强支持细胞与其他细胞的通信联系，对生殖细胞的发育和功能产生重要影响。上述结果为理解低压低氧环境对生殖系统的影响提供了新线索。本研究亦存在一定局限性：(1)缺乏对减数分裂各时期精子细胞的分析；(2)未对各类型精子细胞之间的细胞通讯进行分析。后续研究应进一步对各类精子细胞进行细化，从功能、调控网络、细胞通讯等多角度对精子细胞进行深入研究。

综上，生殖功能正常是个体繁衍和种族延续的基础，作为具有多种生理效应的支持细胞，其可为精子生长和成熟提供营养支持和功能保护。本研究分析了低压低氧环境暴露对支持细胞的干扰及其通讯信号变化，有助于明确支持细胞的作用机制，为后续开展临床研究提供数据支持和研究方向。