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Integrin αvβ3 Targeted Radiopharmaceutical 99mTc-RGD Combined with Anti-PD-L1 mAb to Enhance the Anti-tumor Effect in Tumor Immunotherapy
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摘要:目的 探讨诊断类放射性核素99mTc标记的多肽精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)对肿瘤免疫微环境的调控作用以及联合抗程序性死亡受体配体1(programmed death-ligand 1，PD-L1)抗体增强抗肿瘤治疗的效果。方法 采用流式细胞术对肿瘤细胞的PD-L1表达水平进行检测，采用单光子发射计算机断层显像(single photon emission computed tomography，SPECT)评估99mTc-RGD在MC38肿瘤鼠中的分布情况，采用99mTc-RGD联合抗PD-L1抗体对MC38肿瘤鼠模型进行治疗，评价其抗肿瘤治疗效果。结果 经99mTc-RGD诱导后，CT26、MC38、4T1和B16F10肿瘤细胞表面的PD-L1表达水平均显著上调，差异具有显著统计学意义(P均＜0.01); 以MC38肿瘤鼠为模型，对其注射99mTc-RGD并进行SPECT显像，结果显示存在明显的肿瘤摄取; 99mTc-RGD联合抗PD-L1抗体治疗MC38肿瘤鼠模型的研究结果表明，不同的给药剂量和时间窗可对联合治疗效果产生显著影响，18.5 MBq或37 MBq 99mTc-RGD联合抗PD-L1抗体在间隔4 h时间窗时产生最佳治疗效果。结论 99mTc-RGD可诱导肿瘤细胞表面PD-L1表达水平上调，联合抗PD-L1抗体可增强抗肿瘤治疗效果。Abstract:Objective To investigate the effect of 99mTc-labeled RGD peptide (99mTc-RGD) on regulating the tumor immune microenvironment and enhancing the anti-tumor effect of immunotherapy when combined with anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) antibody.Methods The expression of PD-L1 on tumor cells was detected by flow cytometry, and the distribution of 99mTc-RGD in MC38 tumor mice was evaluated using single photon emission computed tomography(SPECT) imaging. The combination therapy was performed to monitor the anti-tumor effect.Results The expression of PD-L1 on CT26, MC38, 4T1 and B16F10 tumor cells was upregulated after being induced by 99mTc-RGD, and there was a statistical significance between 99mTc-RGD treated and untreated groups. Subsequently, SPECT imaging was performed by injecting 99mTc-RGD into MC38 tumor-bearing mice, and significant tumor uptake was observed. Based on this, the combination of 99mTc-RGD and anti-PD-L1 antibody in MC38 tumor mice was studied, and the results showed that different doses and time windows had significant effects on the efficacy of the combination therapy. The combination of 18.5 MBq or 37 MBq 99mTc-RGD with an anti-PD-L1 antibody led to the best therapeutic effect at 4 h intervals.Conclusions 99mTc-RGD could induce the upregulation of tumor PD-L1 expression, and when combined with an anti-PD-L1 antibody, it could enhance the anti-tumor effect.
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Keywords:
- radiopharmaceuticals /
- PD-L1 /
- tumor immunotherapy /
- tumor models
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听力学涉及声学基础知识、听觉、前庭功能、听力障碍、前庭功能障碍的诊断、治疗、康复等多方面内容，是独立于耳鼻喉科的一门学科，患者主要为听力损失者。我国目前听力残疾患者人数高达2780万[1]，随着社会老龄化日趋严重，所患听力疾病的损失程度随着年龄增长而加重[2]，对于相关听力学的诊治需求日益增加。听力学诊治是医学治疗、功能评估与康复密切配合的过程，需要耳鼻喉科医生与听力师密切合作。欧美发达国家在听力学诊治方面的整体水平处于领先地位，听力学家通过国家认证后可独立接诊患者。而我国目前开设的听力学教育项目以本科专业培养模式为主，缺乏“听力师”这一职业认证及专业的听力师门诊[3-5]。听力损失患者依旧由耳鼻喉科医师负责诊治，因此对于耳鼻喉科医生听力学方面的专业性要求更高。然而在耳鼻喉科临床研究生培训过程中，关于听力学方面的学习内容较少，仅局限于耳鼻喉科教材的理论教学，难以满足临床需求。更加系统的听力学培训对于耳鼻喉科医生及临床研究生充分掌握听力学知识具有重要意义。因此，本研究对于听力学内容进行了理论知识授课与实践见习相混合的教学模式探索，以期改善耳鼻喉科研究生的学习效果。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
以2019—2021年于北京协和医院耳鼻喉科学习的耳鼻喉科临床型研究生及规范化培训的住院医师为研究对象。
1.2 方法
结合既往教学经验[6-7]及其他听力学教学模式[8]，开展听力学实践与理论课程相融合的教学模式。依据前期问卷调查结果及往期授课经验编写教材，理论课程以多媒体教学为主，实践课程多为“一对一”教学。具体流程见图 1。
1.2.1 问卷设计
本研究主要依据听力学教材将听力学课程内容划分为主观行为测听、声导抗测试、客观电生理检查、平衡功能检查与康复、人工听觉干预、儿童听觉评估6个模块，每个模块细分为25个相关测试方法条目，围绕上述内容开展问卷调查。课程开设前进行听力学相关知识重要程度、了解程度、学习意愿调查，课程开设后进行听力学相关知识了解程度及满意度调查，分别从课程时间安排、质量、设计形式、难易程度以及对于临床工作的帮助5个方面对各学习模块进行满意度调查。问卷分值满分为7分，分值越高表示程度越高：1分代表“一点也不”，2分代表“少许”，3分代表“有些”，4分代表“中度”，5分代表“较大”，6分代表“很大”，7分代表“极大”。问卷调查以纸质问卷和网上问卷星填写两种方式进行，详细问卷内容可参见https://www.wjx.cn/jq/48230583.aspx(听力学课程相关知识重要性及了解程度调查问卷)、https://www.wjx.cn/jq/48552746.aspx(听力学课程相关知识学习意愿调查问卷)、https://www.wjx.cn/vj/wIwIzdL.aspx(听力学课程相关知识学习满意度调查问卷)。
1.2.2 课程设计
在听力学课程开设前(2019年9—10月)对学员进行了听力学知识重要程度、了解程度及学习意愿调查，参考调查结果，学员对于理论知识各个模块的临床应用学习倾向性更高，基本原理略高于测试方法，同一模块不同测试方法之间学习意愿程度也有一定差别。基于我科既往教学经验及调查结果，依据听力学专业教材，有针对性地对理论与实践教学内容进行设计，于2019年10月—2020年10月编写课程内容，各模块侧重于临床应用讲解与实际案例讨论分析。于2020年10月—2021年3月进行理论与实践课程教学。理论授课安排在每周二中午学科大查房之前，共计12课时，每课时为1 h，每次理论课程授课结束后安排相应授课内容的实践教学，课时安排详见表 1，整个教学过程持续6个月，每个模块的时间跨度依据整体课时比重安排，例如主观行为测听占整体课时30%，则理论与实践总学习时间跨度为7周左右。由于参与学员的年级分布、接触耳鼻喉科的时间及对听力学知识的了解程度均有差异，学员可根据自身情况调整实践学习时间，每周按需进行“一对一”实践学习。由听力实验室技术人员在听力学实验室、助听器室、人工耳蜗调机室等进行带教，让学生观摩测试过程，了解不同耳鼻喉科疾病相应的临床听力学表现。
表 1 听力学教学模块课时安排学习模块 理论知识与实践课时比 占整体课时比重
(%)主观行为测听 3∶2 30 声导抗测试 3∶2 10 客观电生理检查 4∶1 20 平衡功能检查与康复 4∶1 20 人工听觉干预 4∶1 10 儿童听觉评估 3∶2 10 1.3 统计学处理
采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。问卷得分以中位数(四分位数)表示，组间比较采用Kruskal-Wallis H检验；课程学习前后了解程度得分比较采用两相关样本非参数检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般资料
共26名学员参与各模块学习并完成问卷调查，其中男生8名，女生18名。包括正在进行规范化培训的住院医师5名，临床型在读博士研究生6名，临床型在读硕士研究生14名，基地培训住院医师1名。接触耳鼻喉科时间为1~132个月，平均时间(33±31.93)个月。
2.2 学习前相关知识重要程度评分
课程开设前相关知识重要程度评分在5~7分之间，各学习模块之间重要程度评分相比差异无统计学意义(P=0.674)(表 2)。
表 2 听力学课程学习前相关知识重要程度评分结果[M(P25, P75)，分]学习模块 评分 主观行为测听 6(5, 7) 声导抗测试 6(5, 7) 客观电生理检查 6(5, 7) 平衡功能检查与康复 6(5, 7) 人工听觉干预 6(6, 7) 儿童听觉评估 6(5, 7) P值 0.674 2.3 听力学课程学习意愿评分
听力学课程学习意愿评分如表 3所示，不同学习模块之间基本原理(P=0.331)、测试方法(P=0.374)、临床应用(P=0.764)学习意愿评分，差异无统计学意义。每个学习模块临床应用学习意愿评分与测试方法、基本原理比较差异均有统计学意义(P均＜0.001)，测试方法与基本原理学习意愿评分相比差异无统计学意义(P=0.105)。
表 3 听力学课程学习意愿评分结果[M(P25, P75)，分]学习模块 基本原理 测试方法 临床应用 主观行为测听 6(5, 7) 6(5, 7) 6(5, 7)* 声导抗测试 6(5, 7) 6(5, 7) 7(5, 7)* 客观电生理检查 6(5, 7) 6(5, 7) 6(5.75, 7)* 平衡功能检查与康复 6(5, 7) 6(5, 7) 6(6, 7)* 人工听觉干预 6(4, 7) 6(4, 7) 6.5(5, 7)* 儿童听觉评估 5.5(5, 7) 5.5(4, 6.25) 6(5, 7)* *与基本原理、测试方法比较，P均＜0.001 2.4 听力学课程学习效果
听力学课程学习后学员对听力学知识了解程度均高于听力学课程学习前，各模块学习前后的了解程度相比差异均有统计学意义(P均＜0.001)(表 4)。
表 4 学习前后学员对听力学课程的了解程度评分比较[M(P25, P75，分)]学习模块 学习前 学习后 P 主观行为测听 3(2, 4) 6(5, 7) ＜0.001 声导抗测试 3(2, 4) 6(5, 7) ＜0.001 客观电生理检查 3(2, 4) 6(5, 6) ＜0.001 平衡功能检查与康复 3(1.75, 3) 6(4, 6) ＜0.001 人工听觉干预 2(1, 3) 5(4, 7) ＜0.001 儿童听觉评估 3(1, 3) 5(5, 7) ＜0.001 2.5 听力学课程满意度
听力学课程学习后学员满意度均较高，不同学习模块间课程时间安排、课程质量、课程设计形式、课程难易程度、对于临床工作的帮助满意度相比差异均无统计学意义(P均＞0.05)。课程难易程度中位满意度评分为6分，相对其他四个方面评分低，差异有统计学意义(P均＜0.001)，见表 5。
表 5 听力学课程学习后满意度评分[M(P25, P75), 分]学习模块 时间安排 课程质量 设计形式 难易程度 对于临床工作的帮助 主观行为测听 7(6, 7) 7(6, 7) 7(6, 7) 6(5, 7)* 7(7, 7) 声导抗测试 7(6, 7) 7(6, 7) 6(6, 7) 5(5, 7)* 7(6, 7) 客观电生理检查 7(6, 7) 7(6, 7) 6(6, 7) 6(5, 7)* 7(6, 7) 平衡功能检查与康复 7(6, 7) 7(6, 7) 7(6, 7) 6(5, 7)* 7(6, 7) 人工听觉干预 7(6, 7) 7(6, 7) 7(6, 7) 6(5, 7)* 7(6, 7) 儿童听觉评估 7(6, 7) 7(6, 7) 6(6, 7) 6(4.75, 7)* 7(6, 7) 总体满意度 7(6, 7) 7(6, 7) 7(6, 7) 6(5, 7)* 7(6, 7) P值 0.976 0.510 0.764 0.665 0.896 *与课程时间安排、课程质量、课程设计形式、对于临床工作的帮助满意度评分比较，P均＜0.001 3. 讨论
听力学涉及很多声学基础知识，充分理解和掌握听力学相关知识是学好耳科学的前提。对于临床型研究生来说，学习这些基础知识是一个从无到有的过程，想要做到熟练掌握和灵活应用确实有一定难度，因此需投入更多的时间并且接受更为专业的指导。既往我科临床型研究生主要在耳鼻喉科病房、门诊、急诊轮转，但缺少在听力学实验室、助听器室、人工耳蜗调机室等的轮转机会，只有在接诊耳科疾病患者时，才能接触到听力学报告，却无法深入理解报告内容。然而，只有深入了解每一项听力学检查的原理、测试中可能出现的情况等，才能在临床中合理使用各种听力学检查工具，并给予听力损失患者治疗后的康复建议。因此有必要在研究生教学工作中引入听力学课程教学新模式，使学生深入了解听力学的专业知识，提高实践能力。
在课程开设前通过问卷形式调查学员对听力学知识的认识情况及了解程度，结果显示，听力学相关知识重要程度评分较高，体现出学员对于听力学知识在临床工作中的重要性有足够的认识，对于这方面知识有很大需求。而对于听力学相关知识了解程度评分较低，说明其对于听力学知识的了解相对较少，在临床工作中运用听力学知识存在瓶颈，侧面证实了进行专业听力学课程教学是十分必要的。我科据此设计听力学理论教学课程，使学员对于听力学有了系统全面的认识，了解其在临床中的应用价值。
由于研究对象由多个年级的临床型研究生和规范化培训的住院医师构成，其接触耳鼻喉专业的时间、听力学基础知识的储备及对各个模块的了解程度均有较大差异，因此本研究根据学员个人需求及时间安排实践，使学员在巩固理论知识的同时，了解各种耳鼻喉科疾病的临床听力学表现，并能够独立进行听力学临床诊断。
目前，我科推行的混合教学模式已初见成效。对比课程学习前后学员对于听力学知识的了解程度发现，在经过听力学课程培训后，学员对于听力学知识的了解更加深入，对于临床工作的实际应用帮助较大。学习后满意度调查表明该教学模式取得了学员的认可，对于授课教师、带教老师的主观评价满意度也较高。总体而言，本研究可优化我科听力学教学模式，帮助学员全面了解掌握听力学理论知识，有效提高学员对听力学的学习兴趣、学习效率和操作能力，从而达到为患者提供更好医疗服务的目的。此外，该研究收集了学员对于听力学课程的安排、质量、设计、难易程度、对于临床工作的帮助等方面的满意度，为今后听力学教学的提升与改善提供了帮助。
本研究仍有一些不足之处：(1)课程难易度设计方面有待完善，后续需调整理论知识授课构成，将测试原理简单化；(2) 根据问卷调查结果可考虑理论授课方式的多样性，增加教学视频或者线上教学[9]，此次课程的反馈结果主要对调查问卷得分进行统计分析，然而问卷形式的主观性较强，可考虑增设学习成果的测试与反馈机制，切实帮助学生解决问题，加深理解各种听力学测试方法；(3)带教老师在教学实施前应接受相应的理论知识与技能培训，提高师资水平；(4)本研究为单中心研究，学员数量相对较少，无法进行组间对照，后续可将本研究的经验在多中心进行推广，并开展多中心、更加系统的研究，从而对混合教学模式在听力学内容方面的应用提供更多经验。
综上，混合教学模式在耳鼻喉科临床型研究生与规范化培训的住院医师教学过程中已初见成效，可为其在之后的临床诊断工作中提供较大帮助。但该教学模式仍面临理论与操作技能课程设置、技能评估方法开发等问题, 需在今后进一步教学实践中加以优化与完善。
作者贡献：文雪君负责实验设计、实验操作、数据处理、文献查阅及论文初稿撰写；周吴昊负责文献查阅和资料收集；郭志德、张现忠负责选题设计，并指导论文修订。利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突 -
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图 1 流式细胞术评估肿瘤细胞表面PD-L1表达水平变化
A.99mTc-RGD诱导后4种肿瘤细胞在不同时间窗的PD-L1表达水平上调情况；B. 99mTc-RGD诱导后4种肿瘤细胞在不同时间窗的PD-L1表达水平定量结果(*P＜0.01，**P＜0.001)
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图 3 99mTc-RGD联合αPD-L1改善MC38肿瘤鼠模型的治疗效果
A. 99mTc-RGD联合αPD-L1抗体治疗MC38肿瘤鼠模型的程序和时间窗示意图(当肿瘤体积达到50 mm3左右时开始治疗，小鼠被随机分为13组，每组8只，治疗第4天行第二疗程给药)；B.不同治疗组MC38肿瘤鼠模型90 d内单只小鼠的肿瘤生长曲线
#区分不同的给药剂量；99mTc-R: -
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