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Integrin αvβ3 Targeted Radiopharmaceutical 99mTc-RGD Combined with Anti-PD-L1 mAb to Enhance the Anti-tumor Effect in Tumor Immunotherapy
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摘要:目的 探讨诊断类放射性核素99mTc标记的多肽精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)对肿瘤免疫微环境的调控作用以及联合抗程序性死亡受体配体1(programmed death-ligand 1，PD-L1)抗体增强抗肿瘤治疗的效果。方法 采用流式细胞术对肿瘤细胞的PD-L1表达水平进行检测，采用单光子发射计算机断层显像(single photon emission computed tomography，SPECT)评估99mTc-RGD在MC38肿瘤鼠中的分布情况，采用99mTc-RGD联合抗PD-L1抗体对MC38肿瘤鼠模型进行治疗，评价其抗肿瘤治疗效果。结果 经99mTc-RGD诱导后，CT26、MC38、4T1和B16F10肿瘤细胞表面的PD-L1表达水平均显著上调，差异具有显著统计学意义(P均＜0.01); 以MC38肿瘤鼠为模型，对其注射99mTc-RGD并进行SPECT显像，结果显示存在明显的肿瘤摄取; 99mTc-RGD联合抗PD-L1抗体治疗MC38肿瘤鼠模型的研究结果表明，不同的给药剂量和时间窗可对联合治疗效果产生显著影响，18.5 MBq或37 MBq 99mTc-RGD联合抗PD-L1抗体在间隔4 h时间窗时产生最佳治疗效果。结论 99mTc-RGD可诱导肿瘤细胞表面PD-L1表达水平上调，联合抗PD-L1抗体可增强抗肿瘤治疗效果。Abstract:Objective To investigate the effect of 99mTc-labeled RGD peptide (99mTc-RGD) on regulating the tumor immune microenvironment and enhancing the anti-tumor effect of immunotherapy when combined with anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) antibody.Methods The expression of PD-L1 on tumor cells was detected by flow cytometry, and the distribution of 99mTc-RGD in MC38 tumor mice was evaluated using single photon emission computed tomography(SPECT) imaging. The combination therapy was performed to monitor the anti-tumor effect.Results The expression of PD-L1 on CT26, MC38, 4T1 and B16F10 tumor cells was upregulated after being induced by 99mTc-RGD, and there was a statistical significance between 99mTc-RGD treated and untreated groups. Subsequently, SPECT imaging was performed by injecting 99mTc-RGD into MC38 tumor-bearing mice, and significant tumor uptake was observed. Based on this, the combination of 99mTc-RGD and anti-PD-L1 antibody in MC38 tumor mice was studied, and the results showed that different doses and time windows had significant effects on the efficacy of the combination therapy. The combination of 18.5 MBq or 37 MBq 99mTc-RGD with an anti-PD-L1 antibody led to the best therapeutic effect at 4 h intervals.Conclusions 99mTc-RGD could induce the upregulation of tumor PD-L1 expression, and when combined with an anti-PD-L1 antibody, it could enhance the anti-tumor effect.
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Keywords:
- radiopharmaceuticals /
- PD-L1 /
- tumor immunotherapy /
- tumor models
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嗜铬细胞瘤原发于肾上腺髓质或肾上腺外嗜铬细胞, 可分泌肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺[1]。该病罕见[2-3], 发病率仅2~8/100万[4]。有研究显示糖尿病与嗜铬细胞瘤存在一定关联[5-7], 15%~35%的嗜铬细胞瘤患者可出现糖耐量异常[8-9]。嗜铬细胞瘤患者儿茶酚胺水平升高, 致使胰岛素分泌功能受损[10-14]并增加胰岛素抵抗[15-17], 同时儿茶酚胺水平增高也与糖摄入减少、糖异生和糖原分解增加有关[6]。在切除嗜铬细胞瘤后, 上述效应迅速消除甚至反转, 部分术前无糖尿病患者术后会出现短暂的反弹性低血糖[3, 7], 而部分合并糖耐量受损的患者术后短期内可表现为胰岛素敏感性增强[3], 大部分患者术后糖尿病可获得远期缓解甚至治愈[18]。遗憾的是上述均为小样本研究, 我国尚缺乏这方面研究。
本文通过单中心回顾性分析, 探究我国嗜铬细胞瘤并发2型糖尿病患者术后血糖的变化及其可能的预测因素。
1. 对象与方法
1.1 对象
回顾性收集并分析2012年1月至2016年12月在华西医院确诊的129例肾上腺嗜铬细胞瘤并接受根治性手术切除患者的临床资料。
纳入患者需同时满足以下3条标准:(1)通过术后病理检查及术前儿茶酚胺检查明确诊断嗜铬细胞瘤; (2)行嗜铬细胞瘤根治性手术切除; (3)诊断2型糖尿病需口服降糖药物或注射胰岛素控制血糖。符合下列1条即可确诊为并发2型糖尿病:(1)既往有2型糖尿病诊断记录; (2)排除胰岛素绝对缺乏情况后, 胰岛素功能测定符合下列1条者:①正在采用降糖措施控制血糖; ②糖化血红蛋白≥6.5%;③口服葡萄糖耐量试验2 h血糖≥11.1 mmol/L。
排除标准:(1)未接受嗜铬细胞瘤根治性切除手术者; (2)合并糖尿病以外的代谢性疾病。
1.2 分组
根据患者术后糖尿病缓解与否, 将患者分为缓解组与未缓解组。术后糖尿病缓解定义为:在血糖控制良好的基础上, 术后停用降糖药物或降糖方案较术前用药剂量/种类减少, 或术后空腹血糖水平≤6.1 mmol/L[19]。术后糖尿病未缓解定义为:术后降糖方案及空腹血糖水平均较术前无改善。
1.3 临床资料采集
收集患者术前相关资料, 包括年龄、性别、体质量指数(body mass index, BMI)、肿瘤直径、血浆儿茶酚胺水平(去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺)、影像学检查、术前3 d内及术后第2天空腹血糖水平及降糖方案; 术后长期随访并记录术后1年空腹血糖水平。
1.4 统计学方法
计数资料如性别、术后糖尿病缓解例数使用卡方检验进行比较; 计量资料如年龄、BMI、肿瘤直径、血糖等结果以均数±标准差形式表达并通过t检验进行统计学分析; 血浆儿茶酚胺水平使用中位数及四分位数表示, 采用秩和检验进行比较; 使用单因素Logistic回归分析可能影响术后血糖水平的因素。以上统计分析由SPSS 16.0软件计算完成, P＜0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般资料
共129例嗜铬细胞瘤患者接受根治性手术切除治疗, 影像学表现如图 1所示; 其中33例并发2型糖尿病, 发生率为25.6%(33/129)。33例患者中27例随访资料完整, 男性8例, 女性19例, 平均年龄(51±9)岁(表 1)。
表 1 27例嗜铬细胞瘤并发2型糖尿病患者基本信息分组 性别[n(%)] 年龄(x±s, 岁) BMI(x±s, kg/m2) 肿瘤直径(x±s, cm) 术前血浆去甲肾上腺素[M(Q), ng/L] 术前血浆肾上腺素(ng/L) 空腹血糖(x±s, mmol/L) 男 女 术前 术后 缓解组(n=21) 8(38.1) 13(61.9) 50±10 22±4 5.27±2.31 1804 (908, 5544) 182 (49, 635) 8.90±6.70 4.90±1.38* 未缓解组(n=6) 0(0) 6(100) 53±4 23±2 4.17±1.81 1218 (598, 8188) 138 (44, 240) 7.92±1.59 5.97±1.01 P值 0.092 0.511 0.606 0.296 0.457 0.355 0.728 0.090 BMI:体质量指数; 与术前血糖比较, *P＜0.01 2.2 糖尿病缓解情况
随访资料完整的27例患者术前均采用药物控制
血糖, 其中17例注射外源胰岛素, 10例口服降糖药。术后15例患者完全停用降糖治疗(7例术前口服降糖药, 8例术前注射外源胰岛素), 6例药物用量较术前减少(口服降糖药和注射外源胰岛素者各3例), 总体缓解率为78%(21/27);术后降糖方案较术前无变化者6例, 未缓解率为22%(6/27)。两组患者术后总体空腹血糖较术前显著降低[(8.68±5.94) mmol/L比(5.14±1.37) mmol/L, P＜0.01], 未缓解组亦较术前降低但无统计学差异(P=0.111)(表 1)。
2.3 预测因素分析
两组患者在性别、年龄、BMI、肿瘤直径、术前血去甲肾上腺素及血肾上腺素等方面均无统计学差异(P均＞0.05, 表 1)。单因素Logistic回归分析显示, 患者年龄、性别、BMI、肿瘤直径、术前血浆去甲肾上腺素及肾上腺素水平与术后糖尿病缓解无关(表 2)。
表 2 单因素Logistic回归分析影响术后糖尿病缓解的预测指标因素 β值 SE值 Wald值 自由度 P值 OR值 95% CI 年龄 0.034 0.050 0.463 1.000 0.496 1.034 0.939~1.140 性别 -20.430 14 210.361 0.000 1.000 0.999 0.000 - BMI 0.067 0.126 0.284 1.000 0.594 1.070 0.835~1.370 肿瘤直径 -0.274 0.261 1.100 1.000 0.294 0.760 0.455~1.269 血浆去甲肾上腺素 0.000 0.000 0.000 1.000 0.986 1.000 1.000 血浆肾上腺素 -0.002 0.002 0.752 1.000 0.386 0.998 0.994~1.002 BMI:同表 1 3. 讨论
本研究中嗜铬细胞瘤并发2型糖尿病的发生率为25.6%, 与Beninato等[14]的研究结果(23.5%)相近。约15%~35%的嗜铬细胞瘤患者会出现糖耐量受损[8-9], 与本研究结果一致。
患者无论术前是否合并糖耐量受损, 术后血糖均可出现下降[15]。本研究结果亦提示术后空腹血糖较术前显著降低, 其机制可能是切除肿瘤后, 儿茶酚胺水平降低, 对血糖上调作用减弱, 胰岛素分泌增加, 胰岛素抵抗减弱, 患者糖耐量异常得到改善。
遗憾的是, 本研究尚缺失术后儿茶酚胺水平检测数据, 无法进行相关分析, 今后需进一步检测术后儿茶酚胺水平以验证其对术后血糖影响及其可能的机制。
本研究中年龄、性别、BMI、肿瘤大小、血浆肾上腺素和去甲肾上腺素水平均非术后糖尿病缓解的预测因素。但Beninato等[18]的研究却提示, BMI是嗜铬细胞瘤患者术后糖尿病缓解的独立预测因素, BMI越小, 术后糖尿病缓解的可能性越高, 与本研究结论相反。可能由于嗜铬细胞瘤分泌的儿茶酚胺激活脂肪分解, 导致体重降低, 进一步降低BMI; 本研究中患者术前体重数据存在部分缺失, 仅能以术后随访所得数据予以补充, 也可能在一定程度上干扰了对BMI与糖尿病缓解之间关系的判断。此外, Beninato等[18]的研究亦提示肿瘤大小与术后糖尿病缓解相关, 肿瘤体积越大, 术后糖尿病缓解的可能性越大, 这可能与肿瘤体积大的患者儿茶酚胺水平高, 增加糖耐量受损或糖尿病患病风险有关。本研究未显示肿瘤大小及儿茶酚胺水平与术后血糖缓解之间的相关性, 笔者推测可能与血儿茶酚胺水平波动较大有关, 而尿儿茶酚胺水平相对稳定, 但由于尿儿茶酚胺数据缺失, 无法进行单因素分析, 是本文的研究缺陷之一, 今后收集尿儿茶酚胺资料进一步分析可能会得出新的结论。BMI和肿瘤直径是否为独立预测因素尚需大样本前瞻性研究进一步明确。
嗜铬细胞瘤并发2型糖尿病患者在切除肿瘤后, 糖尿病病情可得到明显缓解甚至治愈, 年龄、性别、BMI、肿瘤直径、术前血浆肾上腺素和去甲肾上腺素并非术后糖尿病缓解的预测因素, 这一结论尚需大样本研究进一步验证。
作者贡献：文雪君负责实验设计、实验操作、数据处理、文献查阅及论文初稿撰写；周吴昊负责文献查阅和资料收集；郭志德、张现忠负责选题设计，并指导论文修订。利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突 -
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图 1 流式细胞术评估肿瘤细胞表面PD-L1表达水平变化
A.99mTc-RGD诱导后4种肿瘤细胞在不同时间窗的PD-L1表达水平上调情况；B. 99mTc-RGD诱导后4种肿瘤细胞在不同时间窗的PD-L1表达水平定量结果(*P＜0.01，**P＜0.001)
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图 3 99mTc-RGD联合αPD-L1改善MC38肿瘤鼠模型的治疗效果
A. 99mTc-RGD联合αPD-L1抗体治疗MC38肿瘤鼠模型的程序和时间窗示意图(当肿瘤体积达到50 mm3左右时开始治疗，小鼠被随机分为13组，每组8只，治疗第4天行第二疗程给药)；B.不同治疗组MC38肿瘤鼠模型90 d内单只小鼠的肿瘤生长曲线
#区分不同的给药剂量；99mTc-R: -
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