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摘要: 血流动力学优化是重症医学危重患者复苏的关键，处理延迟或不当将不可避免地造成机体灌注不足、组织缺氧和多器官功能障碍，从而影响患者结局。血流动力学管理的关键原则是根据当前组织代谢情况优化血流及氧流。要实现这一目标需要获取并监测血压、心输出量、器官特异性自动调节和组织微循环等参数。鉴于指标的多样性和连续性，通过临床监测提供的数据十分庞大，同一时段可有近百项数据客观呈现患者的病理生理状态，而不同时段的数据变化可为患者的病情进展描述提供理论支撑。因此，基于毫秒级高分辨率数据的时域/频域整合分析，即颗粒化多模态监测，将促进血流动力学认知与实践迈入微观化，有助于更清晰地判断患者病情并进行更精准的治疗。Abstract: Hemodynamic optimization is key to resuscitation of critically ill patients in intensive medicine. Delayed or improper treatment will inevitably lead to hypoperfusion, tissue hypoxia and multiple organ failure, which affects the patients' outcome. Therefore, early identification of patients at risk and implementation of adequate monitoring and guidance intervention have a profound impact on the results. The key principle of hemodynamic management is to optimize blood flow and oxygen flow according to current tissue metabolism. To achieve this goal, we need to monitor and get blood pressure, cardiac output, organ-specific automatic regulation and tissue microcirculation. However, the clinical monitoring data is huge. At the same time nearly one hundred pieces of data objectively present the pathophysiological state of the patient, and the changes of data at different time periods can describe the progress of the patients' condition. Therefore, the integrated analysis of time/ frequency domain based on millisecond-level high-resolution data will promote the understanding and practice of hemodynamics at microcosmic level, and help to facilitate clearer judgment and more precise treatment of patients' condition.
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Keywords:
- multimodal monitoring /
- hemodynamic /
- sepsis /
- critically ill
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青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis，AIS)是一种以脊柱三维畸形为主要特征的骨科疾病，多发生于10~18岁青少年，其约占所有脊柱侧凸的90%，影响1%~3%青少年的身心健康[1-2]。该病具有一定的遗传倾向性，但具体病因未明，且存在明显的Carter效应，女性发生率约为男性的2~10倍，可能与多基因遗传模式相关，男性需更大的遗传负荷才会发病[3]。
SPRY4基因属于可编码富含半胱氨酸和脯氨酸蛋白质家族的成员之一，具有调控生长发育的作用。本团队前期研究发现，AIS患者骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)中SPRY4水平显著下调，敲低SPRY4或SPRY4表达缺失可损害MSCs向成骨细胞分化，导致骨骼发育异常，可能为AIS的诱发因素[4]。此外，本研究团队在AIS患者MSCs中发现54个既往未被识别的差异性表达的微RNA(microRNA，miRNA)，其可通过多种信号通路调控MSCs分化[5]。由于SPRY4基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)亦可影响MSCs分化，推测其可能通过与miRNA相结合，进而发挥影响MSCs分化、促进AIS发病的效应。miRNA主要与3′非编码区(3′untranslated region, 3′UTR)结合[6]，此区域不仅可在调节mRNA定位方面发挥重要作用[7]，同时是调控mRNA稳定性、正确时空翻译的重要结构[8]，有助于揭示人类疾病和进化的因果关系[9]。本研究针对3′UTR区域位点，首次探究了中国汉族人群SPRY4基因多态性与AIS的相关性，以期为AIS病因学研究提供新的证据。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
本研究为回顾性分析，研究对象为2017年12月—2021年12月北京协和医院AIS患者及健康受试者。AIS患者纳入标准：(1)依据临床表现及正侧位X线片确诊为AIS且Cobb角＞20°；(2)发病年龄为10~18岁；(3)中国北方地区(黄河以北的区域，如河北省、山东省、山西省、北京市和天津市等)汉族人群。排除标准：(1)合并其他原因导致的脊柱畸形；(2)影像学资料不完整；(3)合并影响骨骼发育的慢性疾病。
健康受试者纳入标准：(1)体检健康，无研究相关疾病；(2)中国北方地区汉族人群；(3)按照年龄、性别与AIS患者进行1∶1匹配。排除标准：(1)全脊柱X线片、MRI等影像学资料不完整者；(2)合并影响骨骼发育的慢性疾病。
本研究已通过北京协和医院伦理审查委员会审批(审批号：JS-3403)，并豁免患者知情同意。
1.2 研究方法
收集AIS患者的AIS分型及AIS患者与健康受试者年龄/性别信息、SPRY4基因测序结果。AIS主流的手术分型包括King分型、Lenke分型及PUMC分型，其中以PUMC分型的可信度和可重复性最佳，且适合脊柱三维矫形，其将AIS分为Ⅰ型(单弯)、Ⅱ型(双弯)和Ⅲ型(三弯)[10]。本研究根据全脊柱X线片，记录AIS患者的PUMC分型。
SPRY4基因检测方法：(1)样本收集：采集空腹外周静脉血2 mL置于EDTA抗凝管中，-80 ℃保存备用。(2)基因组提取及测序：采用酚-氯仿抽提法提取全基因组DNA，并溶于TE缓冲液。基因组DNA经Nano Drop分光光度计测定纯度和浓度后，采用全基因组测序方法对SPRY4基因rs3797053、rs10040443位点SNP进行分型检测，记录各位点等位基因频率、基因型、遗传模式等，所有测序工作均由深圳华大基因科技有限公司完成。
1.3 样本量估算
本研究为病例对照研究，以C等位基因频率作为主要观测指标进行样本量估算。检索国家生物技术信息中心数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term=) 后发现，AIS患者rs10040443位点等位基因C的频率为8.4%，而健康人群仅为5%，在检验水准a=0.05，把握度为90%，样本比例为1∶1的情况下，经计算两组所需最低样本均为97例。
1.4 统计学处理
采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。等位基因频率、基因型、PUMC分型等计数资料以频数(百分数)表示，组间比较采用卡方检验或Fisher精确概率法。采用卡方检验进行Hardy Weinberg遗传平衡检验。采用多因素Logistic回归法分析SPRY4基因rs3797053、rs10040443位点SNP与AIS的关联性。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般临床资料
共入选符合纳入与排除标准的AIS患者97例，健康受试者100名。健康受试者中，男性15例，女性85例；平均年龄(14.48±1.13)岁；SPRY4基因rs3797053、rs10040443位点均符合Hardy Weinberg遗传平衡定律(P均＞0.05)，提示各位点基因分布处于平衡状态，样本具有代表性。AIS患者中，男性13例，女性84例；平均年龄(14.45±1.11)岁；rs10040443基因型频率分布偏离Hardy Weinberg遗传平衡定律，提示与疾病易感性存在关联。
2.2 SPRY4基因rs3797053、rs10040443位点基因型及等位基因分布与AIS的关联性
AIS患者rs10040443位点等位基因C及CC基因型频率均高于健康受试者(P均＜0.05)，rs3797053位点等位基因频率及基因型分布与健康受试者均无显著差异(P均＞0.05)，见表 1。
表 1 AIS患者与健康受试者SPRY4基因rs3797053、rs10040443位点基因型及等位基因分布比较[n(%)]组别 rs3797053 rs3797053 rs10040443 rs10040443 A G AA GA GG C T CC CT TT 健康受试者(n=100) 126(63.0) 74(37.0) 40(40.0) 46(46.0) 14(14.0) 16(8.0) 184(92.0) 1(1.0) 14(14.0) 85(85.0) AIS患者(n=97) 133(68.5) 61(31.5) 45(46.3) 43(44.3) 9(9.4) 34(17.5) 160(82.5) 10(10.3) 14(14.4) 73(75.3) P值 0.245 0.499 0.005 0.014 AIS：青少年特发性脊柱侧凸 进一步采用多因素Logistic回归分析校正性别因素后发现，在各种遗传模式下，rs3797053位点多态性与AIS均无明显关联性(表 2)；在共显性、隐性及加性遗传模式下，rs10040443位点多态性与AIS存在关联性，其CC基因型可增加AIS发生风险(表 3)。
表 2 校正性别因素后，SPRY4基因rs3797053位点与AIS的关联性分析[n(%)]遗传模式 健康受试者(n=100) AIS患者(n=97) OR(95% CI) P值 共显性 0.460 AA 40(40.0) 45(46.4) 1 GA 46(46.0) 43(44.3) 0.83(0.46~1.51) GG 14(14.0) 9(9.3) 0.57(0.22~1.46) 显性 0.340 AA 40(40.0) 45(46.4) 1 GA+GG 60(60.0) 52(53.6) 0.77(0.44~1.36) 隐性 0.280 AA+GA 86(86.0) 88(90.7) 1 GG 14(14.0) 9(9.3) 0.63(0.26~1.53) 超显性 0.800 AA+GG 54(54.0) 54(55.7) 1 GA 46(46.0) 43(44.3) 0.93(0.53~1.64) 加性 0.78(0.51~1.19) 0.230 AIS：同表 1 表 3 校正性别因素后，SPRY4基因rs10040443位点与AIS的关联性分析[n(%)]遗传模式 健康受试者(n=100) AIS患者(n=97) OR(95% CI) P值 共显性 0.010 TT 85(85.0) 73(75.3) 1 CT 14(14.0) 14(14.4) 1.16(0.52~2.60) CC 1(1.0) 10(10.3) 11.64(1.46~93.10) 显性 0.093 TT 85(85.0) 73(75.3) 1 CT+CC 15(15.0) 24(24.7) 1.86(0.91~3.82) 隐性 0.0026 TT+CT 99(99.0) 87(89.7) 1 CC 1(1.0) 10(10.3) 11.38(1.43~90.66) 超显性 0.950 TT+CC 86(86.0) 83(85.6) 1 CT 14(14.0) 14(14.4) 1.04(0.47~2.31) 加性 1.96(1.12~3.43) 0.015 AIS: 同表 1 2.3 AIS患者SPRY4基因rs3797053、rs10040443位点基因型与性别及PUMC分型的关联性
AIS患者中，SPRY4基因rs3797053位点基因型分布与性别、PUMC分型均无明显关联性(P均＞0.05)；rs10040443位点基因型分布与性别亦无明显相关(P＞0.999)，但与PUMC分型具有一定关联性(P＜0.001)，CT+TT基因型患者中PUMC Ⅱ型的比例显著高于CC基因型患者(66.67% 比0，P＜0.001)，见表 4。
表 4 不同性别、PUMC分型AIS患者SPRY4基因rs3797053、rs10040443位点基因型分布比较[n(%)]基因位点 性别 PUMC分型 男性 女性 Ⅰ型 Ⅱ型 Ⅲ型 rs3797053 AA 6(6.2) 39(40.2) 17(17.5) 24(24.8) 4(4.1) GA 6(6.2) 37(38.1) 9(9.3) 27(27.8) 7(7.2) GG 1(1.0) 8(8.2) 2(2.1) 7(7.2) 0(0) P值* ＞0.999 0.315 rs10040443 CC 1(1.0) 9(9.3) 6(6.2) 0(0) 4(4.1) CT 2(2.1) 12(12.4) 7(7.2) 5(5.2) 2(2.1) TT 10(10.3) 63(64.9) 15(15.4) 53(54.6) 5(5.2) P值* ＞0.999 ＜0.001 *采用Fisher精确概率法；AIS：同表 1 3. 讨论
本研究基于病例对照设计，首次探究了中国北方汉族人群SPRY4基因多态性与AIS的相关性，结果发现AIS患者SPRY4基因rs10040443位点等位基因C及CC基因型频率均较健康受试者升高；校正性别因素后，rs10040443位点在共显性、隐性及加性遗传模式下均与AIS具有关联性，该位点CC基因型与AIS发生风险增加有关。在SPRY4基因多态性与性别、AIS临床表型相关性的分析中发现，rs10040443位点基因型与PUMC分型亦存在一定关联性，提示SPRY4基因rs10040443位点可能参与了AIS发病，为该病的病因学研究提供了新思路。
SPRY可通过特异性抑制成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)受体、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)受体和血管内皮生长因子(vascular endothlial growth factor, VEGF)受体活性，在人类胚胎干细胞增殖与存活的调控中发挥重要作用。目前已知的SPRY家族由SPRY1、SPRY2、SPRY3及SPRY4组成[11-13]，其中SPRY1和SPRY2编码蛋白是晶状体囊泡分离和角膜分化的必需物质，SPRY3参与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路的负性调控[14]。SPRY4基因位于5q31.3，由5个外显子组成，其编码蛋白为受体转导的MAPK信号通路抑制剂，并可破坏活性单体GTP结合蛋白(GTP-rat sarcoma, GTP-RAS)的形成。研究显示，SPRY4是人类胚胎干细胞中表达最高的两个Sprouty家族成员之一[15-18]。在不同类型细胞中，SPRY4调控生长因子信号的应答效应存在差异[19]。Li等[20]研究发现，SPRY4在体内与体外对人脂肪源性间充质干细胞(human adipose tissue derived mesenchymal stem cells, hAMSCs)的脂肪形成均有促进作用。与之不同，沉默C57BL/6小鼠骨髓中SPRY4表达可阻断脂肪堆积，该现象或可解释AIS患者体脂率普遍较低的原因[21]。由于肌肉和脂肪含量增加分别可将脊柱侧凸发生风险降低20%和13%[22]，而SPRY4蛋白可调控脂肪形成，故推测其与AIS具有一定相关性。此外，成骨细胞和软骨细胞分化功能障碍可能是AIS的促进因素，敲低健康人群软骨细胞中SPRY4基因可引起软骨细胞肥大、衰老、活性降低，并促进活性氧和细胞外基质表达，进而导致脊柱两侧软骨生长板生长速度不一致，诱发AIS[23]。
既往文献已证实，3′UTR区域可与miRNA相结合发挥骨骼生长发育调控作用。如Song等[24]研究发现，rs4148941位点(A等位基因)转录物与miR-513a-5p的相互作用可能与腰椎间盘退变具有一定关联性。FGF2的3′UTR区域中存在与中国人群骨矿物质密度相关的位点，且其功能受miR-196a-3p的调节[25]。检索文献未发现SPRY4基因多态性与AIS关联性的相关研究。本研究以rs3797053与rs10040443位点为切入点，首次在中国汉族人群中探究了SPRY4基因多态性与AIS的关联性。此两个位点均位于3′UTR区域，且次要等位基因频率均大于5%。单因素分析显示，rs3797053位点等位基因频率及基因型分布在AIS患者与健康受试者之间无显著差异，AIS患者rs10040443位点等位基因C及CC基因型频率高于健康受试者，提示rs10040443位点可能与AIS发病具有相关性；校正混杂因素后此种相关性仍存在，认为rs10040443位点CC基因型可能增加AIS发生风险。
准确的AIS分型是制订临床治疗决策的前提和基础。AIS主要包括三大分型系统，即King分型、Lenke分型及PUMC分型，其中PUMC分型更适合指导AIS患者进行三维矫形[26]。本研究发现AIS患者SPRY4基因rs10040443位点CC+TT基因型与PUMC Ⅱ型具有一定关联性，CC+TT基因型的AIS患者更可能表现为PUMC Ⅱ型。由于AIS由多个基因调控且受多个环节、多种因素的影响，这可能从理论层面解释了AIS患者存在不同程度畸形的原因。
本研究局限性：(1)虽然初步认为SPRY4基因rs10040443位点多态性与AIS具有相关性，但目前尚缺乏足够的分子机制研究证据，二者是否具有因果关系尚需进一步验证。(2)AIS患儿在10~18岁期间，其脊柱畸形分型呈现为动态演变的状态，本研究PUMC分型仅为其中一个时间点的静态影像结果，以致研究结果可能存在偏倚。(3)本文研究对象均为中国北方汉族人群，结果外推需谨慎。
综上所述，SPRY4基因rs10040443位点多态性可能与中国北方地区汉族人群AIS具有相关性，该位点CC基因型可能为AIS的危险因素。此外，CT+TT基因型与PUMC Ⅱ型亦具有一定相关性，若AIS患者基因检测结果为CT+TT基因型，则其后期进展为PUMC Ⅱ型的风险增加，该基因位点有望成为预测AIS进展情况的参考指标，并辅助临床进行早期干预。本研究结果有助于明确SPRY4基因多态性与中国汉族人群AIS易感性的关系，为该病的病因学研究提供了新思路，并为临床干预提供了依据。
作者贡献：宋天娇负责文献检索，撰写论文初稿; 王小亭负责提出专业性意见; 晁彦公提出研究思路并负责论文修订。利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突 -
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