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Differences of Intestinal Flora in Children with Autism Spectrum Disorder with Different Levels of Serum Total 25-hydroxyvitamin D
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摘要:目的 探究孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder，ASD)患儿维生素D正常与缺乏状态下的肠道菌群差异及血清总25-羟维生素D[total 25-hydroxyvitamin D，T-25(OH)D]水平与肠道菌群的相关性。方法 回顾性纳入2019年10月至2022年2月于北京协和医院风湿免疫科门诊就诊的1~12岁ASD患儿的临床资料。采用液相色谱串联质谱法检测ASD患儿的血清T- 25(OH)D水平，并根据血清T- 25(OH)D水平将其分为维生素D正常组[T-25(OH)D＞30 μg/L]、不足组[20 μg/L≤T-25(OH)D ≤30 μg/L]和缺乏组[T-25(OH)D＜20 μg/L]。应用生物信息学方法分析ASD患儿的肠道宏基因组测序结果。结果 共46例符合纳入和排除标准的ASD患儿纳入本研究，维生素D正常组、不足组、缺乏组分别为15例、16例、15例。线性判别分析发现，维生素D缺乏组的沃氏嗜胆菌、Adlercreutzia equolifaciens、Asaccharobacter celatus、大肠埃希菌显著升高；而脆弱拟杆菌和Hungatella hathewayi丰度显著降低。沃氏嗜胆菌和Adlercreutzia equolifaciens丰度与血清T- 25(OH)D水平均呈负相关(r=-0.45, fdr=0.055, P=0.002; r=-0.44, fdr=0.055, P=0.003)；脆弱拟杆菌丰度与血清T- 25(OH)D水平呈正相关(r=0.42, fdr=0.073, P=0.004)。结论 ASD患儿的维生素D缺乏状态可能加重肠道菌群紊乱，血清T-25(OH)水平降低可能使潜在有害菌定植增加、益生菌定植减少。本研究为ASD患儿积极补充维生素D提供了证据支持。Abstract:Objective To investigate the differences of intestinal flora in Vitamin D adequacy and deficiency groups of children with autism spectrum disorder(ASD) and the correlation between serum total 25-hydroxyvitamin D [T-25(OH)D] levels and intestinal flora.Methods ASD children who attended the outpatient clinic of the department of Rheumatology and Clinical Immunology of Peking Union Medical College Hospital during October 2009 and February 2022 were retrospectively included in the study. According to the serum T-25(OH)D levels, they were divided into Vitamin D adequacy group[T-25(OH)D > 30 μg/L], Vitamin D insufficiency group[20 μg/L≤T-25(OH)D≤30 μg/L] and Vitamin D deficiency group[T-25(OH)D < 20 μg/L].Serum T-25(OH)D levels were measured using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Human gut metagenome data from these children with ASD were analyzed using bioinformatics methods.Results 46 children with ASD who met the inclusion and exclusion criteria were included in the study. The numbers of patients in Vitamin D adequacy group, Vitamin D insufficiency group and Vitamin D deficiency group were respectively 15, 16 and 15. Linear discriminant analysis revealed that the bacteria abundance of Bilophila wadsworthia, Adlercreutzia equolifaciens, Asaccharobacter celatus and Escherichia coli were significantly enriched, while the bacteria abundance of Bacteroides fragilis and Hungatella hathewayi were significantly lower in the Vitamin D deficiency group. The relative abundance of Bilophila wadsworthia and Adlercreutzia equolifaciens were negatively correlated with serum T-25(OH)D levels(r=-0.45, fdr=0.055, P=0.002;r=-0.44, fdr=0.055, P=0.003), and the relative abundance of Bacteroides fragilis was positively correlated with serum T-25(OH)D levels (r=0.42, fdr=0.073, P=0.004).Conclusions Vitamin D deficiency in ASD may exacerbate ASD flora disorders, and decreased serum T-25(OH)D levels may facilitate potentially harmful bacteria but inhibit probiotic colonization. This study provides partial evidence that children with ASD should be actively supplemented with vitamin D.
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Keywords:
- gut microbiota /
- autism spectrum disorder /
- vitamin D
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幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是人类感染的最常见细菌之一，据估计全球约44亿人发生Hp感染[1]，虽然大多数感染者为无症状，但持续性Hp感染已被证实与胃溃疡、萎缩性胃炎、胃癌等多种慢性进行性胃部疾病具有相关性[2-3]。通过规范的三联或四联方案可根除Hp感染，进而降低胃癌发病率[4-5]，但临床实践中存在抗生素不规范、不合理使用的现象，以致Hp耐药。监测Hp耐药情况一方面可指导临床用药，另一方面有助于减少耐药菌株产生，提高Hp根治率。本研究对近10年来北京大学人民医院消化科门诊患者胃黏膜活检标本分离出的Hp菌株进行体外药敏试验，分析其耐药现状及趋势，以期为临床合理选择抗生素提供依据。
1. 材料与方法
1.1 一般材料
回顾性收集2011年5月—2021年12月北京大学人民医院消化科门诊患者胃黏膜活检标本分离的Hp菌株的药敏试验数据。纳入标准：(1)标本为患者胃黏膜活检标本；(2)Hp经药敏试验培养阳性。排除标准：(1)同一患者多次胃镜检查留取的标本；(2)患者胃镜检查前2周内服用抗生素、质子泵抑制剂(proton pump inhibitor, PPI)、非甾体抗炎药。
本研究已通过北京大学人民医院伦理审查委员会审批(审批号：2023PHB168-001)，并豁免患者知情同意。
1.2 研究方法
1.2.1 主要试剂与仪器
脑心浸液肉汤干粉、Karmali琼脂、添加剂(英国OXOID公司)，新鲜无菌脱纤维绵羊血(北京双智科技有限公司)，5%脱纤维羊血+MH琼脂培养基(美国BD公司)，克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林和四环素的药敏试验纸条(法国BioMérieux公司)；质控菌株ATCC 43504(北京中源合聚生物科技有限公司)；微需氧产气袋(法国BioMérieux公司)，三气培养箱(美国Nuaire公司)。
1.2.2 菌株分离培养及鉴定
参照《幽门螺杆菌感染的基础与临床》[6]，采用无菌眼科镊将标本转移至匀浆器中并同时滴加转送液1~2 mL，研磨5~8次后接种至Hp选择培养基(Karmali培养基)并置于微需氧环境(5% O2、85% N2、10% CO2，相对湿度＞95%)的培养箱中37 ℃孵育3~7 d。选取呈针尖样(直径1~2 mm)的透明菌落(革兰染色为阴性，尿素酶、触酶、氧化酶试验均为阳性)进行转种、纯化，鉴定为Hp菌株后将其混悬于含20%甘油的肉汤中，-70 ℃保存备用。
1.2.3 药敏试验
采用浓度梯度琼脂扩散法(Etest法)进行药敏试验。从生长菌株的平皿中选取孵育72 h的传代培养物，用生理盐水制备浊度为2.0麦氏标准的菌液；吸取100 μL稀释后的菌液置于血MH平皿中并在整个琼脂表面均匀涂抹3次，每次均将平皿旋转60°，晾干后将阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、四环素Etest条贴于平皿中，35 ℃微需氧条件下培养3 d；读取抑菌圈与Etest条的相交处刻度即为该菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentra-tion, MIC)，每批试剂均进行质控菌株检测。
1.2.4 结果判读
参照美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)M45-ED3[7]及欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST)[8]中的标准对常见抗菌药物，包括克拉霉素(MIC≤0.25 mg/L为“敏感”，0.5 mg/L为“中介”，≥1 mg/L为“耐药”)、甲硝唑(MIC≤8 mg/L为“敏感”，＞8 mg/L为“耐药”)、左氧氟沙星(MIC≤1 mg/L为“敏感”，＞1 mg/L为“耐药”)、阿莫西林(MIC≤0.125 mg/L为“敏感”，＞0.125 mg/L为“耐药”)、四环素(MIC≤1 mg/L为“敏感”，＞1 mg/L为“耐药”)，进行耐药性判断并计算菌株敏感率、耐药率及双重(同时对两种药物耐药)/多重耐药率(同时对两种以上药物耐药)。
1.3 统计学处理
采用WHONET 5.6软件进行药敏数据分析，采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。菌株敏感率、中介率、耐药率等计数资料以百分数表示，组间比较采用卡方检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 菌株检出情况
共纳入分离自402份胃黏膜标本(120例患者)且培养阳性的Hp 120株，培养阳性率为29.85%。120例患者中，男性53例，女性67例；平均年龄49岁(范围：18~76岁)；临床诊断为Hp感染45例(37.5%)、慢性胃炎46例(38.33%)，原因待查29例(24.17%)。
2.2 体外药敏试验结果
5种抗菌药物中，Hp对甲硝唑、克拉霉素的耐药性较强，MIC50分别为256 mg/L、8 mg/L，MIC90均＞256 mg/L。120株Hp对甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林和四环素的耐药率分别为75.0%、72.5%、45.8%、12.5%和4.2%(表 1)。
表 1 Hp对5种抗菌药物的体外药敏试验结果(n=120)抗菌药物 耐药率(%) 中介率(%) 敏感率(%) MIC50(mg/L) MIC90(mg/L) MIC范围(mg/L) 甲硝唑 75.0 0 25.0 256 ＞256 0.016~512 克拉霉素 72.5 0.8 26.7 8 ＞256 0.010~512 左氧氟沙星 45.8 0 54.2 0.5 64 0.002~512 阿莫西林 12.5 0 87.5 0.016 0.25 0.010~512 四环素 4.2 0 95.8 0.023 0.25 0.008~16 Hp：幽门螺杆菌；MIC50/MIC90：抑制50%或90% Hp生长所需的最低抑菌浓度；MIC: 最低抑菌浓度 2.2.1 Hp耐药率与患者年龄的关联性
Hp对克拉霉素、阿莫西林的耐药率受患者年龄的影响不明显；随患者年龄增加，Hp对甲硝唑、左氧氟沙星的耐药率整体呈逐渐升高趋势，对四环素的耐药率呈逐渐降低趋势，见图 1。
2.2.2 Hp耐药率与患者性别的关联性
男性Hp感染患者对左氧氟沙星的耐药率低于女性(P=0.007)，不同性别Hp感染患者对甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、四环素的耐药率均无统计学差异(P均＞0.05)，见表 2。
表 2 不同性别Hp感染患者对5种抗菌药物的耐药情况比较[n(%)]抗菌药物 男性(n=53) 女性(n=67) P值 甲硝唑 42(79.2) 48(71.6) 0.384 克拉霉素 38(71.7) 49(73.1) 0.861 左氧氟沙星 17(32.1) 38(56.7) 0.007 阿莫西林 9(17.0) 6(9.0) 0.233 四环素 3(5.7) 2(3.0) 0.466 Hp：同表 1 2.2.3 Hp耐药率与时间的关联性
随时间推移，Hp对克拉霉素耐药率整体呈逐渐升高的趋势，对左氧氟沙星的耐药率呈先增加后降低的趋势，对甲硝唑的耐药率呈波动之势且整体偏高，对阿莫西林、四环素的耐药率受时间变化的影响相对不明显且整体偏低(图 2)。
2.3 双重/多重耐药情况
未发现对5种抗菌药物同时耐药的Hp菌株。双重耐药中，以甲硝唑与克拉霉素同时耐药最为常见(20.0%)，其次为左氧氟沙星与克拉霉素(2.5%)同时耐药，四环素与其他抗菌药物的双重耐药均较少见。多重耐药中，以甲硝唑+克拉霉素+左氧氟沙星同时耐药最为常见(32.5%)，其他形式的多重耐药均相对少见, 见表 3。
表 3 Hp对5种抗菌药物双重/多重耐药结果展示(n=120)抗菌药物 耐药菌株数(n) 耐药率(%) 双重耐药 30 25.0 甲硝唑+克拉霉素 24 20.0 左氧氟沙星+克拉霉素 3 2.5 甲硝唑+左氧氟沙星 1 0.8 克拉霉素+阿莫西林 1 0.8 甲硝唑+阿莫西林 1 0.8 多重耐药 53 44.2 甲硝唑+克拉霉素+左氧氟沙星 39 32.5 甲硝唑+克拉霉素+阿莫西林+左氧氟沙星 6 5.0 甲硝唑+阿莫西林+克拉霉素 2 1.7 甲硝唑+克拉霉素+四环素 1 0.8 左氧氟沙星+阿莫西林+克拉霉素 1 0.8 克拉霉素+阿莫西林+四环素 1 0.8 甲硝唑+阿莫西林+克拉霉素+四环素 2 1.7 甲硝唑+阿莫西林+克拉霉素+四环素+左氧氟沙星 1 0.8 Hp：同表 1 3. 讨论
本研究对北京大学人民医院分离培养的120株Hp的耐药性进行了初步评估。体外药敏试验结果显示，Hp对甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林和四环素的耐药率分别为75.0%、72.5%、45.8%、12.5%和4.2%；双重耐药率为25.0%，其中以甲硝唑与克拉霉素同时耐药最为常见(20.0%)；多重耐药率为44.2%，其中以甲硝唑+克拉霉素+左氧氟沙星同时耐药最为常见(32.5%)。Hp对5种抗菌药物的耐药性与患者年龄、性别及时间变化具有一定关联性。
Hp分离培养是诊断Hp感染的金标准，但由于其需要采集活检标本，因此该方法并非临床诊断Hp感染的常规手段。此外，菌株的分离和培养耗时较久，且培养结果受多种因素的影响。文献[9-10]报道，实验室专业人员技能、活检样本中的细菌载量、胃炎程度、饮酒、溃疡出血、使用抗生素、标本质量、微生物菌群、转运的时间和温度、空气暴露时间等因素均可在一定程度上影响菌群培养结果，进而导致Hp培养阳性率存在差异。本研究402份胃黏膜活检标本共培养阳性Hp 120株，培养阳性率为29.85%，与既往针对上海地区的研究结果近似(26.0%)[11]。
克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林和四环素均为根治Hp感染的常用抗生素，而抗生素耐药是导致根治失败的主要原因，故研究Hp耐药情况一方面有助于在治疗前制定给药方案，另一方面可在治疗效果不理想时指导给药方案的调整。近年来国内外多位学者针对Hp的耐药性进行了调查研究，但结果存在异质性。Bluemel等[12]针对1851例Hp感染且未接受治疗的患者开展调查，结果显示Hp对克拉霉素(11.3%)、左氧氟沙星(13.4%)的耐药率相对较高，对四环素的耐药率较低(2.5%)。Cosme等[13]针对2013—2017年西班牙Hp感染患者的研究表明，Hp对左氧氟沙星、甲硝唑、克拉霉素的耐药率分别为19.3%、17.9%和30.7%，未发现对阿莫西林、四环素耐药菌株。Gao等[14]开展的研究调查了2000—2009年北京地区接受胃镜检查患者的Hp耐药性，结果显示患者对甲硝唑(63.9%)、左氧氟沙星(50.3%)、克拉霉素(37.2%) 的耐药率较高，对阿莫西林(0.3%)、四环素(1.2%)的耐药率较低。一项针对南京地区2017—2019年Hp耐药性的研究得到了相近结果，Hp对甲硝唑的耐药率最高(84.78%)，其次为克拉霉素(42.53%)、左氧氟沙星(25.95%)，对阿莫西林(3.80%)、四环素的耐药率较低(1.08%)[15]。本研究对北京大学人民医院近10年来分离的120株Hp耐药性进行了统计，结果显示Hp对甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林和四环素的耐药率分别为75.0%、72.5%、45.8%、12.5%和4.2%，其耐药率排序与针对北京地区的最新研究结果相符(甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林和四环素初次耐药率分别为68.0%、55.2%、49.7%、0.7%、0)[16]。本研究Hp对克拉霉素耐药率随时间推移整体呈逐渐升高的趋势且甲硝唑耐药率虽呈波动之势但整体偏高，可能与Hp感染后初次治疗时多采用三联方案，克拉霉素、甲硝唑是三联方案的常用药物且甲硝唑常用于牙周炎的治疗，近年来临床应用逐渐广泛相关。本研究Hp对左氧氟沙星的耐药率呈先升高后降低的趋势，可能原因：研究时间段内后期样本量较小，导致了数据偏移。此外，与针对北京地区的早期报道比较后发现[14]，本研究Hp对甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林和四环素的耐药率均有不同程度升高，可能与随着Hp耐药性的增强，再次进行根治性治疗时二次耐药率显著升高有关[16]，亦从侧面反映了Hp对抗菌药物耐药现象的严峻性。国外报道显示，高龄与左氧氟沙星耐药率增加具有一定相关性[12]。本研究中，随患者年龄增加，Hp对甲硝唑、左氧氟沙星的耐药率整体呈逐渐升高趋势，对四环素的耐药率呈逐渐降低趋势，可能原因：甲硝唑和左氧氟沙星除用于根治Hp感染外，尚可用于其他治疗，如牙周炎和女性泌尿系统感染，随着患者年龄增长，抗生素暴露的机会增多，故耐药率增高；而四环素毒的副作用较大，临床使用较少，随抗生素暴露后时间延长耐药性逐渐降低。本研究发现，女性Hp感染患者对左氧氟沙星的耐药率显著高于男性患者，可能与女性患者泌尿生殖系统感染率较高，而左氧氟沙星广泛应用于泌尿生殖系统及呼吸道感染的治疗密切相关。
随着Hp耐药率的升高，双重/多重耐药菌已非少见，其中以对克拉霉素、甲硝唑与其他药物同时耐药为主。针对河北地区Hp感染人群耐药性的研究显示，甲硝唑与克拉霉素的双重耐药率最高，为20.6%(32/155)[17]，在四川Hp感染人群中，双重耐药最多见于克拉霉素和左氧氟沙星同时耐药(26.75%)[18]；在福建省闽东地区、贵州省贵阳地区人群中则均为甲硝唑和左氧氟沙星双重耐药率最高(16.9%、11.97%)[19-20]。上述结果提示，双重耐药Hp菌株的类型在各地区人群中存在差异，可能与不同区域的临床用药习惯不同有关。本研究结果显示，双重耐药率为25.0%，其中甲硝唑与克拉霉素双重耐药率达到了20.0%；在多重耐药的分析中，甲硝唑+克拉霉素+左氧氟沙星同时耐药最为常见(32.5%)，与针对北京地区8年数据回顾性分析的研究结果一致(甲硝唑+克拉霉素+左氧氟沙星同时耐药率为48.8%)[16]，提示Hp对此3种药物的耐药问题已十分严重，亟待调整Hp根治疗法的用药方案。《第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告》[21]指出，对于克拉霉素和甲硝唑双重耐药率＞15%的地区，经验治疗不推荐含克拉霉素和甲硝唑的非铋剂四联疗法，可视情况采用PPI+铋剂+2种抗菌药物的Hp根除方案。此外，鉴于克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星多重耐药现象较普遍，必要时可采用含伏诺哌嗪的三联疗法、五联疗法、大剂量双重疗法及中医药疗法，但此类方案的疗效及其安全性仍需验证。
本研究局限性：(1)样本量较小且为回顾性研究，结果可能受多种因素干扰；(2)研究标本均来自于北京大学人民医院行胃镜检查的患者，结果外推需谨慎。
综上所述，北京大学人民医院分离的Hp菌株对甲硝唑、克拉霉素及左氧氟沙星的耐药率较高，且多重耐药现象严重，应引起临床高度重视。在临床开展Hp根治疗法时，本研究结果可能对抗菌药物的合理选择和科学管理具有指导作用，必要时需进行药敏试验，以辅助用药方案的制订，提高治疗效果，减少耐药菌株产生。
作者贡献：罗欣负责数据处理和论文撰写；庞琨、陈建雄、王泓哲负责数据处理；徐新杰、李兵负责研究指导；贾鑫淼和尤欣负责研究设计、论文修订与审核。利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突 -
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图 3 孤独症谱系障碍患儿肠道菌群差异分类进化树
注：由内至外辐射的圆点代表了菌群由界至种的分类水平，不同水平上的每个圆点代表了该水平上的一个分类群，每个圆点的大小与该分类群的相对丰度成正比，红色圆点代表维生素D缺乏组中显著升高的分类群，绿色圆点代表维生素D正常组中显著升高的分类群，黄色圆点为无显著差异的分类群
表 1 ASD患儿一般临床资料
组别 男性[n(%)] 年龄(x±s，岁) CARS评分(x±s) 重度ASD[n(%)] 维生素D正常组(n=15) 12(80.0) 3.20±1.859 39.00±5.928 10(66.7) 维生素D不足组(n=16) 11(68.8) 3.44±1.459 41.69±6.681 12(75.0) 维生素D缺乏组(n=15) 11(73.3) 4.40±1.056 39.67±6.619 10(66.7) 组别 胃肠道症状[n(%)] 挑食[n(%)] 兴奋[n(%)] 过敏[n(%)] 情绪问题[n(%)] 维生素D正常组(n=15) 15(100) 12(80.0) 15(100) 14(93.3) 12(80.0) 维生素D不足组(n=16) 15(93.8) 15(93.8) 16(100) 12(75.0) 14(87.5) 维生素D缺乏组(n=15) 15(100) 13(86.7) 15(100) 12(80.0) 13(86.7) ASD: 孤独症谱系障碍；CARS：儿童孤独症评定量表 
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表 2 孤独症谱系障碍患儿肠道菌群β多样性分析
分组 置换多元方差分析 R2 P 维生素D缺乏组比正常组 0.0387 0.291 维生素D不足组比正常组 0.0266 0.541 维生素D不足组比缺乏组 0.0316 0.382
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