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Changes of MicroRNA Expression and Apoptosis in Endometrial Glandular Epithelial Cells under Hypoxic
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摘要:目的 探究缺氧环境下子宫内膜腺上皮细胞(endometrial glandular epithelial cell, EEC)中微RNA(micro-RNA，miRNA)表达谱变化及其对凋亡的影响。方法 取对数生长期EEC，接种至六孔板(1×105个细胞/孔)并随机分为缺氧组和对照组。缺氧组、对照组分别置于缺氧环境(O2∶N2∶CO2体积比为1∶94∶5)和正常氧环境(O2∶CO2体积比为95∶5)中培养。培养4 h后收集细胞，加入Trizol并提取总RNA。采用高通量测序法测定两组EEC中miRNA表达谱变化，采用实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)法检测miR-7704、miR-7974基因表达水平，采用流式细胞术检测EEC凋亡情况，采用蛋白印迹法(Western blot)检测p53和凋亡相关蛋白表达变化。结果 高通量测序对21种常见miRNA表达水平检测后发现，与对照组比较，缺氧组EEC中16种miRNA表达上调，5种miRNA表达下调；其中对照组表达丰度较高的miR-7704和miR-7974在缺氧组表达下降最为显著(P均＜0.05)。RT-PCR结果显示，与对照组比较，缺氧组EEC中miR-7704和miR-7974相对表达量分别降低20%、80%。流式细胞术检测结果显示，缺氧组早期凋亡率及晚期凋亡率均高于对照组(P均＜0.001)。Western blot检测结果显示，与对照组比较，缺氧组EEC中p53表达升高，抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2表达降低(P均＜0.05)。结论 缺氧环境可诱导EEC中miRNA表达谱改变，其中以miR-7974表达下调最为显著。p53可能是miR-7974的靶蛋白，缺氧诱发的EEC凋亡可能通过下调miR-7974水平而促进p53表达实现。Abstract:Objective To explore the changes in the transcription levels of microRNAs(miRNAs) in endometrial glandular epithelial cells (EECs) under hypoxia and their effects on apoptosis.Methods EECs were seeded into six-well plates in logarithmic growth phase(1×105 cells/well), and divided into two groups: hypoxia group and control group. The cells in both hypoxia group and the control group were placed in a hypoxic environment (the volume ratio of O2∶N2∶CO2 was 1∶94∶5) and cultured in normoxic environment (O2∶CO2 volume ratio of 95∶5). All cells were collected after they were cultured 4 h, and Trizol was added into the cells and total RNAs were extracted. High-throughput sequencing was used to detect the changes of miRNAs expression profiles in the two groups of EECs. Subsequently, realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the gene expression of miR-7704 and miR-7974. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of EECs. The protein expression changes of p53 and apoptosis-related proteins were detected by Western blot.Results High-throughput sequencing detected the expression levels of 21 common miRNAs. Compared with the control group, 16 miRNAs were up-regulated and 5 miRNAs were down-regulated in the EECs of the hypoxia group; the expression of miR-7704 and miR-7974 decreased most significantly in the hypoxia group(all P < 0.05). RT-PCR results showed that compared with the control group, the relative expression levels of miR-7704 and miR-7974 in EECs of the hypoxia group decreased by 20% and 80%, respectively. The results of flow cytometry showed that the ratio of early apoptotic cells and late apoptotic cells in the hypoxia group was higher than that in the control group (all P < 0.001). The results of Western blot showed that the expression of p53 in EECs in the hypoxia group increased, and the expression of the anti-apoptotic protein B-cell lymphoma-2 decreased compared with the control group(all P < 0.05).Conclusions Hypoxic environment can induce changes in the expression profile of miRNAs in EECs, among which the down-regulation of miR-7974 is the most significant. p53 may be the target protein of miR-7974, and hypoxia-induced EEC apoptosis may be achieved by down-regulating the level of miR-7974 and promoting the expression of p53.
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Keywords:
- endometrial glandular epithelial cells /
- hypoxic /
- miR-7704 /
- miR-7974 /
- apoptosis
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血源稀缺、昂贵及不恰当输血可能导致并发症增多及死亡率增加[1]，因而临床用血策略备受关注。异体血用量一直是评价医院血液管理水平的重要指标，北京协和医院2015年度输血量大于等于20 U手术患者用血量占手术科室总用血量的43%，比例较大。这些患者通常手术难度大、风险高，术中大量失血，术后常伴有贫血、凝血功能紊乱、器官低灌注等，故临床用血量较大，然而输血本身也是影响患者术后生存率的独立危险因素[2]。本研究通过回顾性分析此类患者的血液管理特点，探讨可改进空间，以期为今后此类患者的围术期血液管理提供参考。
资料和方法
资料
通过北京协和医院病案检索系统，对2015年度入院的手术患者，以单次住院期间用血量大于等于20 U为条件进行检索，符合条件患者共39例，其中3例为非外科相关因素用血(肿瘤术后放化疗致骨髓抑制重度贫血2例，血小板减少1例)，予以排除，研究共纳入患者36例。收集36例患者的人口统计学信息，手术类型(包括是否为急诊手术；是否经历非计划二次手术)，美国麻醉医师协会(American Society of Anesthesiology，ASA)分级，术前血红蛋白(hemoglobin, Hb)水平，手术备血量，术中出血量，术后引流量，术中及术后输血治疗[包括悬浮红细胞(1 U=200 ml)、血浆(1 U=100 ml)、血小板(1 U=1治疗量)、自体血]种类及累计总量，术后30及90 d生存率等数据。
统计学处理
所有数据采用SPSS 20.0统计软件分析，符合正态分布的计量资料以x ±s表示，组间比较采用t检验；不符合正态分布的计量资料以M(四分位间距)表示，组间比较采用独立样本秩和检验。计数资料采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。
结果
本研究36例手术患者平均年龄(53±17)岁；男性23例，女性13例；基本外科12例，肝脏外科7例，妇科5例，骨科4例，心外科2例，产科2例，胸外科1例，泌尿外科1例，血管外科1例及耳鼻喉科1例；术前平均Hb为(111± 27)g/L。
36例患者中急诊手术7例，择期手术29例；非计划二次手术12例；手术类型有肿物切除术(包括嗜铬细胞瘤切除术、胰十二指肠切除术、肝脏肿物切除术、妇科肿瘤细胞减灭术、腹膜后肿物切除术、椎管内占位切除术、胸腔占位切除术、直肠癌根治术、胆管癌根治术、胃癌根治术)，急诊剖腹探查术(消化道出血、产后出血)，剖宫产术，腹主动脉瘤腔内隔绝术及血肿清除术；ASA分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ级分别为2、21、11、1和1例；术中出血量(3425±4334)ml；术后引流量(3628±3318)ml；术后30和90 d生存率分别为72.2%和64.0%。
36例患者中住院期间死亡13例，死亡原因为感染性休克、失血性休克、凝血功能障碍及多脏器功能衰竭等。
18例患者存在术前贫血，其中急诊手术6例，择期手术中5例处于中度贫血状态(表 1)。
表 1 18例贫血患者术前血红蛋白水平与手术时机血红蛋白(g/L) 手术时机(例) 急诊手术 择期手术 90~120 1 7 60~＜90 3 5 30~＜60 2 0 ＜30 0 0 总计 6 12 术前平均备红细胞(6.59±2.98)U，术中输注(8.72±8.67)U；术前平均备血浆(770.59±270.74)ml，术中输注(797.14±699.78)ml。术前备血量与术中实际用血量差异有统计学意义(单边左尾t检验，P＜0.05)，表明备血量不少于术中输注量，术前备血充足。
结合术前诊断与评估，36例患者中仅4例符合自体血回输仪应用指征，在初次手术中全部应用自体血回输技术。
经历非计划二次手术患者共12例，初次手术种类包括胰十二指肠切除术4例，胆管癌根治术2例，联合肝段切除术1例，经肛门联合腹腔镜直肠癌根治术1例，剖宫产术1例，产后出血盆腔探查术1例，腹腔镜嗜铬细胞瘤切除术1例，卵巢癌再次肿瘤细胞减灭术1例。其中2例非计划手术2次，1例非计划手术3次，均为剖腹探查止血术。未经历非计划二次手术患者与经历非计划二次手术患者初次手术相关数据见表 2。未经历非计划二次手术患者术中出血量明显多于经历非计划二次手术患者(P＜0.05)。
表 2 未经历与经历非计划二次手术患者初次手术相关数据比较非计划二次手术 例数 ASA分级(Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ) 术中出血量(ml) 术后引流量(ml) 未经历 24 0/12/10/1/1 3000(1200, 6150) 2400( 650, 4543) 经历 12 2/9/1/0/0 1300( 650, 2000)* 3600(2450, 9950) ASA：美国麻醉医师协会；与未经历非计划二次手术患者比较，* P＜0.05 非计划二次手术患者初次择期手术与非计划手术(多次非计划手术患者仅分析其第一次非计划手术)相关信息比较结果表明，非计划手术患者术前ASA分级明显高于初次手术，术中出血量及输血量亦明显增多(P均＜0.05)(表 3)。
表 3 非计划二次手术患者手术相关数据手术时机 ASA分级(Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ) 术中出血量(ml) 术中输血量 红细胞(U) 血浆(ml) 初次手术 2/9/1/0/0 1050(600, 2000) 1(0, 5) 100(0, 800) 非计划二次手术 0/0/4/8/0 2250(1000, 4000)* 8(4, 10)* 400(400, 1400)* ASA:同表 2；与初次手术比较，* P＜0.05 讨论
输血一直是治疗外科患者围术期贫血及失血的主要措施，除了在急性失血情况下紧急补充血容量外，外科患者在整个围术期均有可能输血[3]。尽管输血疗效显著，但输血带来的相关并发症不容忽视，包括免疫功能紊乱、严重输血反应、疾病传播、肿瘤复发/转移风险增加及术后感染发生率升高[2]。为此，临床合理用血、减少不必要的输血至关重要[2-3]。
本研究入组患者主要来自基本外科、肝脏外科、妇产科、骨科，上述科室2015年度总用血量在本院手术科室排名位居前10名；且入组患者用血量占其科室总用血量的比例较大，其中基本外科和肝脏外科输血量大于等于20 U患者的用血量在科室用血量中所占比例大于30%(数据来源于北京协和医院输血科报告)。本研究回顾性分析此类患者的相关用血数据，为今后此类患者围术期血液管理提供参考依据。
纠正术前贫血
本研究36例患者中18例术前存在贫血，其中择期手术患者12例，5例处于中度贫血状态。尽管贫血早已被证实为围术期并发症和死亡发生相关风险的独立危险因素，但仍未得到临床医生的广泛重视，据报道围术期贫血在外科患者的发生率高达20%~40%[3]。然而，术前贫血同围术期输血一样是可以预见并且能够纠正的外科相关风险[4]。输血替代方法促进网(Advancement of Transfusion Alternatives，NATA)指南和欧洲麻醉学会(European Society of Anaesthesiology，ESA)指南均推荐，择期手术患者术前4~8周评估Hb水平及相关出血风险[4-5]，以明确诊断术前贫血并为纠正贫血提供足够时机，降低围术期输血的风险。
对于已经明确诊断并发贫血的患者，需积极寻找贫血原因，如高龄、营养不良、长期慢性失血等，这类患者最常表现为缺铁性贫血[6]，英国胃肠病学会指南建议对此类患者应用静脉或口服铁剂补足体内贮存铁[7]。对于排除营养不良导致的贫血患者，NATA指南推荐应用促红细胞生成素，合并静脉铁剂也可提高机体对促红细胞生成素的反应，但仍需充分考虑促红细胞生成素的不良反应，如高血压、血栓栓塞、刺激肿瘤细胞增生等[8]。
术前预测出血量，减少术中出血
本组患者术前备血量不小于术中实际输血量，可以认为相关科室对于手术出血量的评估充分。对于术中预计大出血患者，需采用多种节血措施。
应用自体血回收仪：与异体血输注相比，自体血回输有效性、安全性更高[9]。本组36例患者中仅4例符合“传统”自体血回输仪应用指征，全部应用于术中。由于肿瘤细胞、细菌、病毒等微生物不能被自体血回输仪清除，故恶性肿瘤、感染手术等一直被视为自体血回输仪禁忌证[10-11]。联合使用白细胞滤器被证实能够有效清除回收血液中的肿瘤细胞[12-13]，已有研究推荐将自体血回输仪与白细胞滤器联合应用于一些恶性肿瘤患者。也有证据表明在一些污染手术中，应用广谱抗生素，回输自体血并不会使术后感染发生率增加[14]。随着技术的发展，将有更多的循证医学证据支持将自体血回输仪应用于一些特殊手术，挽救急危重症患者的生命。
采取综合措施减少围术期出血：局部及全身预防性应用氨甲环酸等抗纤溶药物均被证实能够有效减少术中出血及术后引流量[15]。根据患者情况采用个体化麻醉方案，如神经阻滞[16]、体温保护[17]等均有助于减少术中出血。外科术式，如腔镜、3D机器人等微创术式视野曝露良好、操作更加精细，止血也更彻底[18]。血栓弹力图能够及时诊断凝血功能障碍，可为临床用血决策提供依据[19]，已在北京协和医院麻醉科广泛应用。
降低非计划二次手术风险
本组36例患者中12例经历了非计划二次手术，均为剖腹探查止血术。将患者按照是否经历非计划二次手术分成两组，组间对比结果提示非计划二次手术患者初次手术术中出血量明显较低，提示术中出血量小并不代表非计划二次手术风险更低，但也不排除本研究样本量较小，检验结果效能较低的可能。
非计划二次手术患者手术时病情明显重于其初次手术，其中出血量及输血量明显增多，提示非计划手术对患者临床结局具有严重不良影响，应尽量避免非计划手术。本组4例患者的非计划手术发生在初次手术当天，提示对于手术难度较大、预测出血量较多的患者，术中止血操作应更加严密、谨慎，术后密切监测凝血功能及引流情况，以降低非计划二次手术发生率。
综上，对于手术难度较大、风险较高的患者，术前应充分评估出血风险，纠正贫血，采用个体化手术及麻醉方案，密切监测凝血功能，选择合适及必要的措施减少围术期出血，降低二次手术发生率，合理用血，以改善患者结局。
作者贡献：王含必负责研究设计、数据分析、论文撰写；窦帅杰负责实验实施、数据分析、论文撰写；刘思邈、张婉玉、刘美芝负责实验实施；邓成艳为项目总负责人，指导研究设计、论文写作及修改。利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突 -
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图 4 缺氧组和对照组EEC凋亡的流式细胞图
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表 1 RT-PCR引物序列
引物 序列(5′→3′) snoRNA202 上游引物：ACACTCCAGCTGGGGCTGTACTGACTTGATG 下游引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCATCAGAT URP-R TGGTGTCGTGGAGTCG miR-7974 上游引物：ACACTCCAGCTGGGAGGCTGTGATGCTCCCT 下游引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGGCTCAG miR-7704 上游引物：ACACTCCAGCTGGGCGGGGTCGGCGGC 下游引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCACGTCGC RT-PCR：实时荧光定量聚合酶链式反应 
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