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A Bibliometric Analysis of the Global Research Output on Artificial Intelligence Clinical Research
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摘要:目的 探究人工智能(artificial intelligence, AI)在医学领域应用的随机对照试验(randomized controlled trial, RCT)研究现状，以期为我国学者开展AI研究提供思路。方法 检索PubMed数据库，获得AI相关RCT医学研究文献。基于Web of Science数据库获取文献发表时间、被引频次、作者及所在研究机构与国家等信息，并进行归纳总结；采用VOSviewer 1.6.17软件生成作者、研究机构、国家合作的网络图，并对关键词进行聚类分析；采用Cite Space 5.8.R3软件对文献被引情况和关键词进行突发性检测。结果 共获得医学领域内AI相关RCT文献1174篇，篇均被引频次为36.09，发表时间分布于1989至2021年，其中2007年后发文量显著增加。1174篇研究共涉及61个国家、1794个机构、7288位作者，其中发文量居前5位的国家依次为美国(37.22%，437篇)、意大利(10.90%，128篇)、韩国(8.86%，104篇)、德国(8.35%，98篇)、中国(7.84%，92篇)，发文量居前5位的研究机构分别为美国哈佛大学(2.98%，35篇)、韩国延世大学(2.73%，32篇)、美国西北大学(2.21%，26篇)、美国麻省理工学院(2.13%，25篇)、美国斯坦福大学(1.96%，23篇)，发文量居前5位的作者分别为Krebs(22篇，美国麻省理工学院)、Calabro(11篇，意大利IRCCS神经中心)、Picelli (11篇，意大利维罗纳大学)、Smania(11篇，意大利维罗纳大学)、Lin(10篇，中国台湾大学)。高产作者、研究机构、国家之间的合作不充分、不密切。高频关键词聚集为3类：机器人技术在疾病治疗中的应用、机器学习在疾病诊断与管理中的应用和AI在康复训练中的应用。突发性检测结果发现，机器人辅助和机器学习是目前该领域内的研究热点。结论 近年来AI相关RCT医学研究数量增加迅速，虽然发达国家在该领域的研究处于领先地位，但我国的研究者和研究机构亦表现出巨大潜力。目前开展AI相关RCT医学研究的作者、研究机构及国家之间的合作不密切，研究主题有待拓展。Abstract:Objective To explore the research status of randomized controlled trial (RCT) with the application of artificial intelligence (AI) in the medical field, in order to provide insights for Chinese scholars to carry out AI research.Methods AI related RCT researches were obtained by searching PubMed database. The Web of Science was used to obtain the publication year, citations, authors, institutions, and countries of included AI related RCT researches. The VOSviewer 1.6.17 software was used to extract the related information, generate visual cooperation network maps for the country, institutions and authors, and perform cluster analysis for keywords. The Cite Space 5.8.R3 software was used to analyze the burst citation references and keywords.Results A total of 1174 RCTs in AI field were included, with an average citation frequency of 36.09. The publication time was from 1989 to 2021, and the number of articles increased rapidly after 2007. Among them, the top 5 countries with the number of published articles were the United States (37.22%, 437 papers), Italy (10.90%, 128 papers), South Korea (8.86%, 104 papers), Germany (8.35%, 98 papers), China (7.84 %, 92 papers); the top 5 research institutions with the most published papers were Harvard University (2.98%, 35 papers), Yonsei University (2.73%, 32 papers), Northwestern University (2.21%, 26 papers), Massachusetts Institute of Technology (2.13%, 25 papers), Stanford University (1.96%, 23 papers), and the top 5 authors were Krebs (22 papers, Massachusetts Institute of Technology, US), Calabro (11 papers, IRCCS Neural Center, Italy), Picelli (11 papers, University of Verona, Italy), Smania (11 papers, University of Verona, Italy), Lin (10 papers, Taiwan University, China). Insufficient cooperation between prolific authors, research institutions, countries. The main hot topics were the application of robot technology in treatment, the application of machine learning in disease diagnosis and management, and the application of AI in rehabilitation training. Combined with strongest citation burst, it was found that robot assistance and machine learning may be the current research hot topics.Conclusions AI has great application prospects in the medical field, and the number of AI related RCT medical research has increased rapidly in recent years. Although the developed countries are in the leading position in this field, the researchers and research institutions in China have shown great potential. At present, the cooperation between the authors, research institutions and countries conducting AI related RCT medical research is not close, and the research topic needs to be expanded.
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尿路上皮癌是最常见的恶性肿瘤之一，可发生于肾盂、输尿管、膀胱和尿道，其中以膀胱尿路上皮癌最为常见。膀胱尿路上皮癌常用的诊断方法包括尿液细胞学检查、膀胱镜检查，但尿液细胞学检查的灵敏度较低，膀胱镜检查为有创性操作，因此，亟需探寻灵敏度、特异度均较高的分子标志物用于膀胱尿路上皮癌的诊断。胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2, IGF2)是一种包含67个氨基酸的肽类激素，在多种恶性肿瘤组织中呈过表达[1]。外泌体是细胞主动分泌的一类穿梭于细胞间的细胞外囊泡，其中富含各种蛋白质、脂质、核酸等物质，在细胞间传递信号等方面发挥着重要作用[2]。本研究通过荧光定量反转录PCR法检测尿液外泌体中IGF2表达水平，探索其在膀胱尿路上皮癌诊断中的价值。
1. 对象与方法
1.1 研究对象
前瞻性选取2020年9月至12月北京协和医院诊治的膀胱尿路上皮癌患者和非尿路上皮癌患者为研究对象。
膀胱尿路上皮癌患者纳入标准：(1)具有完整的病历资料；(2)经膀胱镜检查或经尿道膀胱肿瘤电切术(transurethral resection of bladder tumor, TURBT)病理确诊为膀胱尿路上皮癌；(3)近期未行泌尿生殖系统操作或手术。排除标准：(1)有其他系统恶性肿瘤史；(2)近期曾行放化疗或者免疫抑制剂治疗者。
非尿路上皮癌患者纳入标准：(1)与膀胱尿路上皮癌患者同期入院；(2)通过CT/MRI等检查诊断为泌尿系结石、泌尿系感染、前列腺增生、肾上腺良性肿瘤等疾病；(3)临床资料完整。排除标准：(1)有其他系统恶性肿瘤史；(2)近期行泌尿生殖系统操作或手术者。
本研究已通过北京协和医院伦理委员会审批(审批号：JS-3178)，患者均签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 样本量估算
依据公式n=Uα2P(1-P)/δ2估算样本量，其中P分别为估计的IGF2诊断膀胱尿路上皮癌的灵敏度(用于膀胱尿路上皮癌组样本量估算，取0.90)和估计的IGF2诊断膀胱尿路上皮癌的特异度(用于非尿路上皮癌组样本量估算，取0.80)；检验水准α=0.05，Uα为正态分布中累积概率为α/2时的U值(U0.05=1.96)。经计算膀胱尿路上皮癌患者样本量为35例，非尿路上皮癌患者为61例。
1.2.2 尿液采集和外泌体提取
患者入院后均留取新鲜晨起清洁中段尿。取尿液标本(约5 mL)，置于无菌无酶离心管中，采用外泌体提取试剂盒(广州恒泰生物科技有限公司产品，粤穗械备20202151号)提取尿液中的外泌体，具体操作步骤依据试剂盒说明书。
1.2.3 核酸提取和反转录
取外泌体沉淀物，加入Trizol 1 mL，15~30 ℃放置5 min，4 ℃, 离心半径8 cm，2000 r/min离心10 min保留上清液。加入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置3 min，4 ℃, 离心半径8 cm，12 000 r/min离心10 min后样本分成3层：黄色的有机相、中间层和无色的水相。将水相转移至新离心管，加入等体积异丙醇，混匀，15~30 ℃静置10 min；4 ℃, 离心半径8 cm，12 000 r/min离心5~10 min；去上清液，缓慢沿离心管管壁加入75% 乙醇1 mL，轻轻上下颠倒洗涤离心管；4 ℃, 离心半径8 cm，12 000 r/min离心2 min后弃乙醇；重复洗涤一次，获取RNA沉淀，室温干燥2~5 min，加入适量DEPC水以溶解RNA沉淀，必要时可用移液器轻轻吹打沉淀，待沉淀完全溶解后立刻进行反转录。反转录体系：1 pg~1 μg规格的RNA 6 μL，gDNA去除液2 μL，移液器吹打混匀，42 ℃保存2 min；向PCR反应管中加入反转录反应液2 μL，移液器吹打混匀后进行反转录，反转录条件：50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 2 min。
1.2.4 PCR检测
从试剂盒中取出PCR反应液、ROX、引物探针混合物、阳性质控品、阴性质控品，于冰上或4 ℃融化后震荡混匀, 离心半径8 cm，8000 r/min瞬时离心后备用。计算待测样本数(n)，取n+2个(包含1个阳性质控品和1个阴性质控品)PCR反应管，单份扩增体系总体积为26 μL，其中15 μL PCR反应液1，11 μL PCR反应液2。加入4 μL待测样本反转录产物，离心半径8 cm，8000 r/min瞬时离心后进行PCR扩增。参数设置：窗口设置：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none，Reporter Dye2：CY5，Quencher Dye2：none，Passive Reference：ROX。循环条件：37 ℃ 2 min，1个循环；95 ℃ 8 min，1个循环；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，45个循环。分别随机选取4例膀胱尿路上皮癌患者和4例非尿路上皮癌患者的PCR产物，行琼脂糖凝胶电泳(图 1)。
1.2.5 结果分析
收集PCR产物，使用配套仪器自动调整基线和阈值，基线Start值为3~15，End值为5~20。在log图谱中调整阈值处于扩增曲线指数期，调整完毕后获取待测样本数据。若CY5通道Ct值≤35且FAM通道Ct值≤36，判定IGF2阳性；若CY5通道Ct值≤35且FAM通道Ct值＞36，判断定IGF2阴性；若CY5通道Ct值＞35，则样本的RNA浓度达不到最低检测限要求，需重新检测。
1.3 偏倚控制
本研究入选的膀胱尿路上皮癌患者均由膀胱镜检查或TURBT病理确诊，非尿路上皮癌患者均为非恶性肿瘤疾病，以避免其他类型恶性肿瘤(如肾癌、前列腺癌等)对研究结果的影响。
1.4 统计学处理
采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。年龄符合正态分布，以均数±标准差表示。IGF2阳性表达率为计数资料，以频数(百分数)表示。以膀胱镜检查或TURBT病理结果为金标准，计算尿液外泌体中IGF2诊断膀胱尿路上皮癌的灵敏度、特异度、阳性似然比与阴性似然比。其中灵敏度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性似然比=灵敏度/(1-特异度)；阴性似然比=(1-灵敏度)/特异度。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般临床资料
共入选符合纳入和排除标准的膀胱尿路上皮癌患者35例，非尿路上皮癌患者60例(肾上腺疾病患者24例，良性前列腺增生症患者22例，泌尿系结石患者14例)。膀胱尿路上皮癌患者中，男性26例，女性9例；平均年龄(65.43±12.22)岁(范围：45~86岁)。非尿路上皮癌患者中，男性35例，女性25例；平均年龄(61.68±13.07)岁(范围：12~82岁)，两组患者年龄、性别比例无统计学差异(P均＞0.05)。
2.2 尿液外泌体中IGF2阳性表达率比较
膀胱尿路上皮癌患者IGF2阳性表达25例(71.4%)，阴性表达10例(28.6%)；非尿路上皮癌患者IGF2阳性表达6例(10.0%)，阴性表达54例(90.0%)。膀胱尿路上皮癌患者尿液外泌体中IGF2阳性表达率显著高于非尿路上皮癌患者(P=0.000)。
2.3 尿液外泌体中IGF2诊断膀胱尿路上皮癌的性能
尿液外泌体中IGF2诊断膀胱尿路上皮癌的灵敏度为71.43%(95% CI：53.48%~84.76%)，特异度为90.00%(95% CI：78.83%~95.87%)，阳性似然比为7.14(95% CI：3.25~15.70)，阴性似然比为0.32(95% CI：0.19~0.54)。
3. 讨论
本研究对尿液外泌体中IGF2与膀胱尿路上皮癌的相关性进行了初步分析，结果表明IGF2在膀胱尿路上皮癌中呈明显高表达(阳性率：71.4%)，其诊断膀胱尿路上皮癌的灵敏度为71.43%(95% CI：53.48%~84.76%)，特异度为90.00%(95% CI：78.83%~ 95.87%)。
全球每年约550 000例新发尿路上皮癌病例[3]，其中膀胱尿路上皮癌占比90%以上。80%的膀胱尿路上皮癌确诊时为非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)，TURBT术切除后复发率高达50%，其中30%进展为肌层浸润性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer, MIBC)[4]。因此，早期诊断对改善膀胱尿路上皮癌患者预后至关重要。虽然常规尿液细胞学检查对膀胱尿路上皮癌具有较高的诊断特异度(88.1%)，但总体灵敏度极低(32%)，其中对高级别膀胱尿路上皮癌的诊断灵敏度为50.6%，对低级别膀胱尿路上皮癌的诊断灵敏度仅为10.3%[5]。
有研究分析了NMP22、CD44、CK20、CEACAM1和BTA 5种尿液肿瘤标志物诊断膀胱尿路上皮癌的临床价值，结果表明NMP22的灵敏度最高(85.1%)，但特异度仅为54.7%；虽然CD44的灵敏度(83.2%)和特异度(84.4%)均可[6]，但尚需临床进一步验证。本次研究旨在探索一种新的无创标志物作为膀胱尿路上皮癌筛查、诊断和随访的替代方案。
外泌体是由不同类型细胞(包括肿瘤细胞)主动分泌直径为50~150 nm的双分子层结构囊泡样小体[7]，在细胞间发挥通讯作用，特别是在肿瘤发展过程中的作用，已得到临床认可。外泌体相关的RNA、微RNA、蛋白质、DNA，甚至代谢物均可通过自分泌和旁分泌方式作用于受体细胞。在血液、尿液、唾液和脑脊液等体液中均可检测到外泌体，是肿瘤辅助诊断理想的非侵袭性或侵袭性生物标志物[8]。
人类IGF2基因定位于染色体11p15，包括9个外显子和4个启动子，是一种有效的促分裂原和凋亡抑制剂，可抑制细胞凋亡，促进细胞周期进展、血管生成，对细胞生长和存活至关重要。IGF2在包括乳腺癌[9]、卵巢癌[10]、结直肠癌[11]和前列腺癌[12]等在内的不同恶性肿瘤组织均呈过表达。早期研究表明，膀胱尿路上皮癌患者尿液中IGF2水平明显升高，证实IGF2是膀胱尿路上皮癌诊断的一种有前景的标志物[13]。一项前瞻性多中心队列研究对4种尿液分子标志物诊断膀胱膀胱癌的性能进行了测试，结果显示IGF2是诊断膀胱尿路上皮癌的核心基因之一[14]。但目前尚缺乏其单独作为标志物诊断膀胱尿路上皮癌临床价值的相关研究。
本研究初步探索了尿液外泌体中IGF2诊断膀胱尿路上皮癌的临床效能，结果表明相较于非尿路上皮癌患者，膀胱尿路上皮癌患者尿液外泌体中IGF2阳性表达率显著升高(71.4%比10.0%)，IGF2诊断膀胱尿路上皮癌的灵敏度为71.43%，特异度为90.00%，相比传统尿液细胞学检测，其灵敏度和特异度均有不同程度的提高[5]；与肿瘤标志物CD44比较，特异度更高，但灵敏度稍低[6]。
本研究局限性：对照人群仅为非尿路上皮癌患者。后期可增加病例收集范围，比较膀胱尿路上皮癌与泌尿系统其他恶性肿瘤患者尿液外泌体中IGF2表达差异，以进一步分析IGF2在膀胱尿路上皮癌鉴别诊断中的作用。
综上，膀胱尿路上皮癌患者尿液外泌体中IGF2呈高表达，其对膀胱尿路上皮癌具有较高的诊断特异度，但灵敏度稍低。由于尿液样本收集简便、易行，尿液外泌体中IGF2有望作为分子标志物辅助膀胱尿路上皮癌的诊断。
作者贡献：史纪元负责文献检索、数据分析、论文撰写；高亚负责论文构思、文献筛选、数据分析；许建国负责文献筛选、数据分析；田金徽负责文献检索、论文修订；李峥负责论文修订与审核。利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突 -
表 1 被引频次居前10位的AI相关RCT医学研究
序号 文章题目 作者及发表时间 期刊名称 被引频次 1 Robot-assisted therapy for long-term upper-limb impairment after stroke Lo等(2010年) N Engl J Med 819 2 Robot-assisted movement training compared with conventional therapy techniques for the rehabilitation of upper-limb motor function after stroke Lum等(2002年) Arch Phys Med Rehabil 739 3 Effect of Robotic-Assisted vs Conventional Laparoscopic Surgery on Risk of Conversion to Open Laparotomy Among Patients Undergoing Resection for Rectal Cancer The ROLARR Randomized Clinical Trial David等(2017年) JAMA 475 4 A novel approach to stroke rehabilitation: robot-aided sensorimotor stimulation Volpe等(2000年) Neurology 414 5 Robot-based hand motor therapy after stroke Takahashi(2008年) Brain 408 6 Multicenter randomized clinical trial evaluating the effectiveness of the Lokomat in subacute stroke Hidler等(2009年) Neurorehabil Neural Repair 398 7 Prospective randomized controlled trial of robotic versus open radical cystectomy for bladder cancer: perioperative and pathologic results Nix等(2010年) Eur Urol 380 8 Comparing open radical cystectomy and robot-assisted laparoscopic radical cystectomy: a randomized clinical trial Bochner等(2015年) Eur Urol 359 9 Effects of robotic therapy on motor impairment and recovery in chronic stroke Fasoli等(2003年) Arch Phys Med Rehabil 349 10 Robot-assisted laparoscopic prostatectomy versus open radical retropubic prostatectomy: 24-month outcomes from a randomised controlled study Coughlin等(2018年) Lancet Oncol 348 注：检索时间为2021年12月1日；AI、RCT: 同图 1 
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