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Expert Consensus on Laboratory Testing for SARS-CoV-2
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摘要: 新型冠状病毒肺炎疫情仍在全球肆虐，实验室检测是疫情防控的关键环节。基于目前实验室检测所积累的经验和难点，结合当前最新研究进展，中国医院协会临床微生物实验室专业委员会组织临床微生物学、分子生物学和免疫学检验相关专家共同制定了《新型冠状病毒实验室检测专家共识》。本共识对新型冠状病毒临床常用检测方法，尤其是核酸、抗体及抗原检测的技术特点、应用注意事项及生物安全要求进行了详细介绍，就目前新型冠状病毒实验室检测和结果解读方面的常见问题提出了解决方案，对核酸和抗体联合检测在不同病程阶段的临床应用及其意义进行了解读，以期为常态化疫情防控期间临床实验室开展新型冠状病毒精准检测提供参考。Abstract: With the global outbreak of the coronavirus disease 2019, the laboratory testing for the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2) has become the key to the epidemic prevention and control. Based on the questions, issues from the clinical practice and the latest research, the Sub-committee of Clinical Microbiology Laboratory, Chinese Hospital Association proposed "Expert Consensus on Laboratory Testing for SARS-CoV-2". The consensus panel is composed by experts in clinical microbiology, molecular biology and immunology laboratory medicine. The consensus describes the technological characteristics, precautions of clinical application, and biosafety requirements. It also includes the coping strategies for the most frequent problems and the challenges in testing and results explanation of commonly used clinical methods including nucleic acid, antibody and antigen tests, and combined testing of nucleic acid and antibody. We expect this consensus could provide guidances and reference opinions on how to conduct the precise laboratory testing for SARS-CoV-2 on the epidemic prevention and control.
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2019年12月，新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起的新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)疫情暴发，并在全球范围内大流行。虽然我国对COVID-19疫情的防控取得了阶段性胜利，但全球疫情仍极为严峻。当前我国疫情防控的重点，已从对本土病例的防控转变为对境外输入性病例的防控，以及对经冷链运输进口物品携带污染及密切接触人群的监测。各临床医疗机构和疾病预防控制部门的SARS-CoV-2检测工作已呈常态化，应大力提升并具备随时应对新一波疫情暴发、流行的能力。基于目前临床检测SARS-CoV-2所积累的经验和常见问题，并结合最新研究进展，中国医院协会临床微生物实验室专业委员会组织我国临床微生物学、分子生物学和免疫学检验相关领域专家共同撰写了《新型冠状病毒实验室检测专家共识》。本共识明确了目前SARS-CoV-2临床常用检测方法的技术特点、注意事项、生物安全要求、检测和结果解读的常见问题及应对策略，以期在疫情防控常态化形势下，为临床实验室正确、高效开展SARS-CoV-2检测提供参考意见。
1. 共识形成方法
本共识由中国医院协会临床微生物实验室专业委员会发起，共识专家组由该委员会委员及其推荐的相关领域专家共同组成，并通过共识形成会议法[1]达成共识意见。专家组拟订关键问题和共识提纲后，以“新型冠状病毒” “新型冠状病毒肺炎” “severe acute respiratory syndrome coronavirus 2”“SARS-CoV-2” “coronavirus disease 2019”和“COVID-19”为关键词，检索2019年12月至2020年11月期间PubMed、EMBase、Cochrane Library、中国知网、万方数据、维普网数据库中关于SARS-CoV-2和COVID-19实验室检测相关的中、英文文献，以及国家卫生健康委员会和世界卫生组织发布的COVID-19诊疗方案和技术标准，国内外学术组织现行的感染控制、生物安全相关标准、指南和共识等。经3轮远程会议讨论及反复修订，形成共识草案，然后由所有专家对草案进行函审并提出书面意见，共收集函审意见539条(含重复意见)，全部意见在第4次会议上逐条进行讨论确认，并采纳其中的458条，经23次修订最终形成本共识终稿。鉴于目前对SARS-CoV-2的认知程度及共识参与人员的专业背景，本共识的制定可能存在一定局限性。
2. 新型冠状病毒核酸检测
2.1 核酸检测方法
国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》[2]指出，对疑似病例采用实时荧光PCR法检测SARS-CoV-2核酸为阳性或病毒基因测序结果与已知的SARS-CoV-2序列高度同源，即可确诊为SARS-CoV-2感染。核酸检测阳性是发现SARS-CoV-2携带者(SARS-CoV-2核酸阳性但无明显临床和影像学表现，且血清特异性SARS-CoV-2抗体阴性者)和确诊SARS-CoV-2感染的金标准。
在SARS-CoV-2基因组序列确定的情况下[3-5]，靶标可针对病毒基因组保守区域进行设计。SARS-CoV-2核酸检测的靶基因主要包括：开放读码框1ab(open reading frame 1ab，ORF1ab)、核壳蛋白(nucleocapsid protein，N)、包膜蛋白(envelop protein，E)和刺突糖蛋白编码(spike glycoprotein，S)基因[6]。目前在中国获批的试剂盒主要是针对其中的一个或多个靶标进行检测，建议同时检测2个及以上靶标，以保证结果的特异度和准确性。
目前国家药品监督管理局(National Medical Pro-ducts Administration，NMPA)批准上市的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒所采用的检测方法主要有实时荧光PCR法、恒温扩增法、联合探针锚定聚合测序法、杂交捕获免疫荧光法、RNA捕获探针法、RNA恒温扩增捕获—金探针层析法、双扩增法以及基于下一代测序技术(next-genera-tion sequencing, NGS)的SARS-CoV-2核酸检测方法等。
2.1.1 实时荧光PCR法
目前医疗机构临床实验室开展SARS-CoV-2核酸检测所采用的方法以实时荧光PCR法为主，其检测下限为102~103 copies/mL，部分产品可达10 copies/mL。该方法检测耗时存在差异，通常两步法(即核酸提取与PCR扩增步骤独立进行)约需3~3.5 h(包括核酸提取0.5~1.5 h，PCR扩增1.5~2 h)，一步法(即核酸提取与PCR扩增一体化)可缩短至1 h以内。
2.1.2 恒温扩增法
恒温扩增法是在固定的温度条件下进行扩增，包含恒温扩增实时荧光法和恒温扩增芯片法。恒温扩增实时荧光法是将恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合，可将SARS-CoV-2核酸检测全流程时间缩短至1.5 h以内。恒温扩增芯片法是将恒温扩增技术与微流控芯片技术相结合，其特点是可在同一份样本中同时检测多种病原体。恒温扩增法具有集成能力强、自动化程度高、检测时间短、检测下限低(可达102 copies/mL)等特点。
2.1.3 其他PCR方法
联合探针锚定聚合测序法、杂交捕获免疫荧光法、RNA捕获探针法、RNA恒温扩增捕获—金探针层析法、双扩增法和巢式多重PCR法在SARS-CoV-2核酸检测中亦发挥了重要作用。在扩增多重病原靶标时，需同时检测1~2种室内质控，以确保样本处理、核酸提取及PCR反应的有效性。此外，也有研究使用PCR-核酸飞行时间质谱进行SARS-CoV-2核酸检测[7]；或应用质谱技术直接使用临床样本从多组学角度检测SARS-CoV-2[8-10]。
SARS-CoV-2核酸检测的方法较多且各具特点，即使同一种检测方法，由于检测试剂生产厂家或检测仪器不同，所需检测时间及检测下限均可能存在差异。因此，在实际工作中实验室应根据所使用的检测试剂及设备说明书，制定相应的标准操作规程，开展SARS-CoV-2核酸检测工作。
2.1.4 基于NGS的SARS-CoV-2核酸检测
NGS不依赖传统的微生物培养，具有高通量、一次可检测多个靶基因的特点，可发现新发病原体、监测病原体变异，为诊断试剂、疫苗、药物等研发和应用提供依据。在此次疫情初期，利用NGS从临床样本中成功鉴定出了SARS-CoV-2的基因组序列[11]，为SARS-CoV-2的早期发现和诊断提供了重要依据。疫情期间，NMPA应急批准SARS-CoV-2测序试剂盒可用于临床样本的常规检测。但目前NGS主要用于科研，其临床大规模应用需进一步标准化和规范化。
2.2 核酸检测注意事项与生物安全要求
SARS-CoV-2核酸检测主要包括样本采集、转运和接收、核酸提取、PCR扩增、报告解读及医疗垃圾处理等步骤。其注意事项及生物安全要求见表 1。
表 1 新型冠状病毒核酸检测常见注意事项及生物安全要求步骤 注意事项 生物安全要求 样本采集 样本类型[2, 12]：
(1)普通筛查：推荐采集鼻咽拭子*[13-14]
(2)发热患者：
①发热门诊筛查：推荐采集鼻咽拭子
②处于疾病早期：推荐采集鼻咽拭子
③处于疾病中后期：除鼻咽拭子外，可采集下呼吸道样本(肺泡灌洗液、深部痰)、粪便、脑脊液[15]等，重症患者优先采集下呼吸道样本[12]
(3)阳性转阴患者：推荐采集鼻咽拭子
(4)疫情时期大规模筛查：推荐采集鼻咽拭子，可根据地方政策混合采样#[16]，不推荐混合检测
(5)环境检测：可根据地方政策混合采样(1)医务人员按照国家相关规定进行全流程防护[12, 17-18]，样本采集时注意避免医务人员与患者之间的交叉感染
(2)样本采集后立即插入含有病毒保存液的样本管，样本管单个装入密封袋
(3)制定样本洒漏应对措施[12]：对样本洒漏环境进行封闭，并使用含氯消毒剂或过氧乙酸消毒[12]；上报医院感控部门，严禁人员流动[19]，经会诊确定是否对暴露人群进行留观隔离
(4)工作结束后使用含氯消毒剂对环境消毒，并应用紫外线照射样本转运 (1)样本直立存放于转运箱内，应三层包装(即内层容器、第二层包装及外层包装)，且包装符合B类(UN3373)标准[12]，密封转运[20]
(2)样本采集后室温放置不宜超过4 h，应在2~4 h内送至实验室检测[21]；如未及时转运，4 ℃储存不宜超过24 h[22]，如需长途运输应使用干冰等低温保存[12]
(3)院间转运需有转运资质，专人专车[20](1)转运容器使用含氯消毒剂或酒精消毒[12]
(2)运输过程注意平稳，避免样本箱坠落导致致病性样本暴露于空气中，如有样本洒漏参照上述方法处理样本接收 (1)在生物安全柜内接收样本并核对样本信息
(2)不合格样本(渗漏、无标识等)登记后及时反馈临床或样本采集地点，并重新采样；不合格样本按生物污染垃圾处理(1)生物安全柜使用酒精消毒，并采用紫外线照射
(2)使用含氯消毒剂对样本管外表面消毒
(3)样本渗漏使用含氯消毒剂消毒，停止检测，密封打包，压力蒸汽灭菌后销毁[12]核酸提取 (1)建议对样本进行物理灭活(如56 ℃ 30 min等[23])或化学灭活(如采用含有胍盐的病毒保存管等[24])
(2)在生物安全二级及以上实验室进行[4]，有条件的单位可采用负压实验室
(3)手工提取规范操作，严格防止污染
(4)自动化提取按要求进行设备维护及消毒(1)实验室空气采用紫外线照射消毒，必要时使用核酸清除试剂
(2)工作台面、地面使用含氯消毒剂或酒精消毒
(3)生物安全柜使用酒精消毒
(4)如使用自动化提取仪，对仪器进行消毒
(5)样本局限性污染使用含氯消毒剂消毒；如样本倾覆，保持实验室空间密封，使用含氯消毒剂消毒，必要时采用过氧乙酸或高锰酸钾-甲醛熏蒸，污染物采用压力蒸汽灭菌处理[12]PCR扩增及报告解读 (1)阴性对照、阳性对照信号合格，方可发布报告
(2)根据样本信号值与试剂产品说明书阈值，进行结果判读(1)扩增过程PCR管密封
(2)对PCR室消毒医疗垃圾处理 (1)废液：化学或物理消毒后，排入实验室水处理系统
(2)固体废物：分类收集，压力蒸汽灭菌处理[12](1)在医疗垃圾产生地使用两层医疗垃圾袋扎口并粘贴“新型冠状病毒相关医疗废物”(或类似字样)后，进行压力蒸汽灭菌
(2)通过医疗废物通道转运垃圾*新型冠状病毒附着在人黏膜上皮细胞，因此刮取鼻黏膜上皮细胞进行检测阳性率高，筛查门诊或疑似患者优先推荐采集鼻咽拭子。鼻咽拭子对新型冠状病毒检测灵敏度优于口咽拭子，其样本采集要求亦高于口咽拭子[13]，样本采集医护人员需经过专业培训[18]；#将拭子混合于样本保存液中，如核酸检测阳性，通知相关部门对混合样本来源患者单个隔离，并逐一采集单管拭子复核[12] 2.3 核酸检测结果解读存在的问题与对策
2.3.1 核酸检测与复检
以下情况建议复检：(1)样本经PCR扩增后，目的基因Ct值大于试剂说明书阈值，但原始峰图有信号；(2)扩增结果为阳性，但原始峰图并非典型的“S”形曲线；(3)双靶标试剂检测结果不一致；(4)双份试剂检测结果不一致；(5)检测结果与临床症状、影像学表现不一致；(6)若不同病程阶段核酸检测结果发生变化，需连续多次采样；(7)大规模人群筛查流行率极低(＜0.1%)时，出现阳性结果，应使用1~2种更灵敏且扩增区域不同的试剂复检[12]。
2.3.2 流行病学结合临床分析原则
虽然核酸检测是SARS-CoV-2病原学诊断的金标准，但仍存在一定的局限性。当临床高度怀疑SARS-CoV-2感染而核酸检测阴性时，需结合患者肺部CT、SARS-CoV-2特异性抗体、血常规等其他检测结果进行综合判断。
2.4 核酸检测结果假阴性、假阳性分析
假阴性结果主要原因：(1)感染的不同时期，病毒在人体不同部位载量存在差异；(2)样本采集不规范；(3)样本转运、保存或灭活方法不当，导致RNA降解；(4)病毒基因序列发生变异。
假阳性结果多由实验室污染或操作不当造成。
2.4.3 避免假阴性或假阳性结果的应对策略
(1) 试剂质量控制：对不同的SARS-CoV-2核酸检测试剂性能进行比较，对试剂的性能参数进行验证，选取各种性能均较好的试剂。
(2) 操作质量控制：核酸检测的整个流程操作复杂，不同产品的反应体系及适用机型等存在差异，实验人员应严格按照各自产品说明书要求进行操作。实验室应对样本采集、转运与保存、核酸提取、PCR扩增、结果审核及报告进行全流程质量控制。
(3) 设置对照：除每个检测批次至少设置3份阴性对照、1份弱阳性对照(第三方质控品)[12]和内标控制孔外，应设置空白对照以监测实验室污染。
(4) 多指标诊断：对核酸检测结果为阴性但临床疑似感染患者，应进行多部位样本、多次采样检测，并结合血清学结果、影像学表现等进行综合判断。
3. 新型冠状病毒免疫学检测
N蛋白和S蛋白是免疫检测的主要抗原靶点。N蛋白位于病毒颗粒包膜内核，与正义单链RNA缠绕并将其封装成RNA核衣壳体；S蛋白分布于病毒外壳，冷冻电镜超微结构为三聚体，其受体结合结构域(receptor binding domain, RBD)与人体细胞血管紧张素转换酶2受体结合后入侵人体细胞并导致感染[25]。
3.1 新型冠状病毒特异性抗体检测
《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》[26]首次将“血清SARS-CoV-2特异性抗体IgM和IgG阳性；血清SARS-CoV-2特异性抗体IgG由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高”作为疑似病例的确诊标准之一。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》[2]将“SARS-CoV-2特异性抗体IgM阳性”作为疑似病例诊断依据之一，并指出“SARS-CoV-2特异性抗体IgM和IgG在发病1周内阳性率较低，一般不单独以血清学检测作为诊断依据，需结合流行病学史、临床表现和基础疾病等情况进行综合判断”，强调动态观察抗体水平变化。因此，核酸检测仍是判断SARS-CoV-2感染的金标准[27]，抗体检测可用于核酸检测阴性疑似病例的补充检测，或在疑似病例诊断中与核酸检测联合应用，但不能代替核酸检测单独作为SARS-CoV-2感染者确诊与否的依据，亦不适用于一般人群的筛查。随着SARS-CoV-2疫苗接种人群的逐渐扩大，详细询问患者疫苗接种史及免疫相关基础疾病，对理解其抗体水平变化趋势及抗体检测结果至关重要。
3.1.1 抗体检测方法
SARS-CoV-2抗体检测试剂多以N蛋白和S蛋白作为捕获抗原，主要检测IgM、IgG。一般情况下，机体感染病毒后抗体水平变化如图 1。IgM产生最早(SARS-CoV-2特异性抗体IgM多在发病3~5 d后开始出现阳性[2, 28])，但浓度及亲和力较低、维持时间短，是急性期感染的诊断指标；IgG产生较晚(一般在出现症状一周后[28-29])，但浓度及亲和力高、维持时间较长(有研究显示SARS-CoV-2特异性抗体IgG维持时间约为3~6个月)，是感染中后期或既往感染的诊断指标[30]。机体感染SARS-CoV-2产生抗体的时间和规律仍需更多的科学研究加以证实。
NMPA已批准的SARS-CoV-2抗体检测方法主要有化学发光法、胶体金法和荧光免疫层析法。化学发光法具有线性范围宽、通量高、自动化程度高、操作易于标准化等特点，但依赖于特定的化学发光检测仪，成本较高，临床普及受限。胶体金法和荧光免疫层析法操作简便、快捷，突破了现有检测技术对人员、场所的限制，可在15 min内获得结果，适用于基层医疗单位及现场筛查，但灵敏度受限[31]。上述方法均为定性检测，目前尚无可用于定量分析的试剂盒。
3.1.2 抗体检测注意事项与生物安全要求
SARS-CoV-2抗体检测的注意事项及生物安全要求见表 2。
表 2 新型冠状病毒抗体检测常见注意事项及生物安全要求主要步骤 注意事项 生物安全要求 样本采集 (1)样本类型：血清、血浆或全血均适用，空腹血最佳，成人建议采集3~5 mL[32-33]，儿童按检测试剂盒要求的标本量进行采集
(2)针对人群：
①疑似患者：核酸检测阴性但有相关流行病学史、且肺部CT检查显示肺内病变符合新型冠状病毒肺炎影像特征的高度疑似患者，建议进行抗体检测辅助诊断
②发热患者：疫情中高风险地区发热患者或暴发流行期间发热患者，按照“1+3检查”模式(新型冠状病毒核酸检测、抗体检测、CT及血常规检测)进行检测；普通发热患者根据国家或地方规定进行检测
③境外入境人员：建议进行核酸抗体联合检测
④普诊筛查：一般不建议进行抗体检测(1)样本采集人员和检测人员应按照国家相关要求进行防护[33]
(2)采集血液样本应使用带有安全装置的针头；其他装备，如止血带，使用一次性装备[34]
(3)采血操作时预防针刺伤，加强职业防护，避免回套针帽、分离锐器等操作[19]
(4)采血拔针环节应注意防止血液迸溅和泄漏，造成环境污染
(5)采血后，使用酒精喷洒消毒采血管，标本单个装入密封袋
(6)工作结束后，使用含氯消毒剂对环境消毒，并应用紫外线照射样本转运 (1)抗体检测样本一般在院内转运，转运容器及要求同核酸检测样本
(2)30 min内送达实验室，一般不宜超过2 h；抵达实验室后，血清样本尽快离心，避免溶血[35](1)转运容器使用含氯消毒剂或酒精消毒
(2)运输过程注意平稳，避免样本箱坠落导致致病性样本在空气中暴露样本保存 (1)3 d内检测可于2~8 ℃存放，保存3 d以上的血清或血浆样本应存放于-20 ℃及以下，长期保存建议存放于-70 ℃及以下，全血样本不得冻存[34]
(2)应与其他样本分开保存，避免反复冻融使用含氯消毒剂或酒精消毒保存容器 样本接收 (1)生物安全柜内接收核对样本信息
(2)不合格样本(渗漏、无标识等)登记后及时反馈临床或样本采集地点，并重新采样；不合格样本按生物污染垃圾处理使用酒精消毒生物安全柜，并采用紫外线照射 样本处理与检测 (1)一般不对样本进行灭活处理
(2)在生物安全二级及以上实验室进行[33]，开盖操作或手工检测应在生物安全柜中进行(1)避免气溶胶传播，定期对实验室空气采用紫外线照射消毒[36]
(2)使用含氯消毒剂或酒精消毒工作台面
(3)使用酒精消毒生物安全柜报告解读 阴性对照、阳性对照及质控结果是否合格 医疗垃圾处理 (1)废液：化学或物理消毒后排入实验室水处理系统
(2)固体废物：分类收集，压力蒸汽灭菌处理[12](1)在医疗垃圾产生地，使用两层医疗垃圾袋扎口并粘贴“新型冠状病毒肺炎相关医疗废物”(或类似字样)后，进行压力蒸汽灭菌
(2)通过医疗废物通道转运垃圾3.1.3 抗体检测结果解读中的问题与对策
3.1.3.1 抗体检测与复检
(1) 在低流行风险人群中，若抗体检测结果呈弱阳性或阳性，建议结合核酸检测等结果进行解读，亦可采用另一种高特异度的方法或试剂盒进行复检；
(2) 如抗体检测结果呈阴性，但临床怀疑为SARS-CoV-2感染，建议进行核酸检测，并采用另一种高灵敏度的方法或试剂盒进行复检；
(3) 如考虑存在干扰因素，可通过样本灭活、使用类风湿因子吸附剂处理等方式处理后，进行复检。
3.1.3.2 不同检测方法间性能存在差异的原因
(1) 原理不同：双抗原夹心法、捕获法、间接法等不同检测方法的灵敏度不同。
(2) 捕获抗原不同：①抗原种类或选择的片段不同：N蛋白的免疫原性和特异度均高于S蛋白，但灵敏度低[37]，不同试剂盒可能单独采用S蛋白、N蛋白或S+N蛋白抗原组合、全长或仅RBD为捕获抗原；②S: N抗原比不同；③体外重组蛋白表达系统不同，真核表达系统表达的蛋白具有一定程度的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达系统表达的蛋白更稳定，特异度更高。
(3) 待检抗体种类不同：如单独检测(IgM或IgG)、双重检测(IgM+IgG)或总抗体检测(IgM+IgG+IgA)，联合检测可提高检出率。
3.1.3.3 抗体检测结果假阴性、假阳性分析
假阴性检测结果的可能原因：(1)抗体表达存在窗口期；(2)检测试剂盒灵敏度受限；(3)样本保存或实验操作不当；(4)轻症患者抗体反应较弱[38]；(5)样本灭活导致低水平抗体降解。
假阳性检测结果的可能原因：(1)不同种属冠状病毒的N蛋白或S蛋白存在免疫交叉反应[39]；(2)患者自身存在高浓度类风湿因子、抗核抗体等免疫学干扰因素[40-41]；(3)实验室或试剂盒污染；(4)样本检测前的灭活可能导致荧光免疫层析法检测假阳性[42]；(5)阳性判断值的设定：阳性判断值附近的弱阳性，有一部分可能为假阳性，因此弱阳性患者建议3~5 d后复查；(6)样本溶血、血液样本凝固不全或患者出现黄疸等，可能会导致假阳性结果，但目前缺乏实验证据，需进一步研究验证。
3.2 新型冠状病毒核酸和特异性抗体联合检测结果解读
核酸检测结果是判断患者有无SARS-CoV-2感染的直接证据，抗体检测结果可作为辅助判断SARS-CoV-2感染的间接证据以及评估疫苗效果，核酸检测与抗体检测各有优劣，不能互相替代。单独采用抗体检测时，其结果解读需谨慎，尤其应核对患者流行病学史、是否接种SARS-CoV-2疫苗及是否合并免疫相关基础疾病。人体感染SARS-CoV-2后核酸载量、抗体水平呈现不同的变化(图 1)，在不同病程阶段，核酸和抗体检测的灵敏度不同，特别是在感染中后期，核酸检出率降低，抗体检出率升高，核酸与抗体联合检测可降低漏诊率，提高检出率，对临床诊断具有重要意义。针对实验室SARS-CoV-2核酸及抗体联合检测结果的解读见表 3。
表 3 新型冠状病毒核酸及抗体联合检测结果解读[31]核酸 抗体 结果解读 IgM IgG - + + 感染恢复期，IgM尚未降低至检测下限或感染活跃期或接种疫苗早期，建议复查核酸和抗体 +/± - 感染急性期或接种疫苗早期，建议复查核酸和抗体 - + 既往感染或已接种疫苗，建议1~2周后复查核酸和抗体 - - 未感染或感染潜伏期，建议采用不同试剂和/或窗口期样本复查，必要时进行动态监测 + + + 感染活跃期 + - 感染早期，IgM已产生，但IgG暂未产生或水平未达到诊断试剂的检测下限 - + 感染期，IgM降低，IgG升高 - - 潜伏期或感染早期等，人体免疫系统尚未产生抗体或水平未达到检测下限，建议3~5 d后复查抗体，并密切医学观察 3.3 新型冠状病毒抗原检测
抗原检测是指应用SARS-CoV-2特异性抗体直接检测样本中的病原体，其结果可作为早期确认该病原体感染与否的直接证据，且具有操作简便、报告时间短等优势。所检测抗原主要是N蛋白和S蛋白，N蛋白在β属冠状病毒之间相对保守、合成数量多，具有很强的抗原性，其抗原决定簇是特异性抗体结合的主要位点。抗原检测适用的样本类型一般为感染部位样本，主要为鼻咽拭子和肺泡灌洗液等。检测结果受样本质量、感染部位及病毒表达量等因素影响较大，灵敏度低、易产生假阴性结果。如何提高抗原检测的灵敏度是影响该检测方法在临床上应用的关键问题，需进一步筛选制备高亲和力和高特异度的抗体，以用于抗原检测试剂的开发。
目前，国内外许多企业致力于SARS-CoV-2抗原检测试剂盒的研发，已有试剂盒获得食品药品监督管理局紧急使用授权并批准上市，NMPA亦应急审批通过2款SARS-CoV-2抗原检测试剂盒上市。
4. 新型冠状病毒培养
细胞培养分离病毒是病原学鉴定的金标准，所获毒株是检测试剂和疫苗开发、抗病毒药物筛选等研究的重要基础。SARS-CoV-2的培养必须在具备生物安全三级(BSL-3)及以上资质的实验室内进行，不得在临床常规生物安全二级(BSL-2)实验室中进行，因此不推荐新型冠状病毒培养作为常规诊断方法。鼻咽拭子、痰及其他下呼吸道分泌物等临床样本均可通过接种人呼吸道上皮细胞、Vero-E6和Huh-7细胞系等进行分离培养。选取经荧光定量PCR和/或NGS方法检测出核酸阳性且Ct值较低(即病毒载量较高)的样本进行分离培养，应考虑取材部位、取材时间及样本送检与保存等因素的影响。
5. 小结
SARS-CoV-2是一种新发病原体，目前对该病毒的致病性、检测方法性能的了解仍有限，需开展更多的基础和临床研究，以提高其检测方法效能、提升临床及实验室诊断能力。本共识基于现有研究结果和相关指南，对SARS-CoV-2实验室检测相关问题进行了分析，并提出了应对策略，以供临床实验室参考和应用。在SARS-CoV-2检测过程中，临床实验室应积极与临床沟通，结合患者流行病学史、临床表现、影像学改变及其他检测结果综合分析。对于未来可能发生甚至目前已经发生的病毒生物学变异所带来的检测挑战，仍有诸多未知因素有待进一步探索和研究。
本共识专家组成员 (按贡献度排序)：
王瑶 (北京协和医院)，李军 (解放军总医院第一医学中心)，宁雅婷 (北京协和医院)，罗燕萍 (解放军总医院第一医学中心)，周泽奇[丹娜 (天津)生物科技有限公司]，林勇平 (广州医科大学附属第一医院)，徐英春 (北京协和医院)，胡继红 (国家老年医学中心中国医学科学院老年医学研究院北京医院国家卫生健康委临床检验中心)，李永哲 (北京协和医院)，马筱玲 (中国科学技术大学附属第一医院)，邵育晓 (北京贝尔生物工程股份有限公司)，张戈 (北京协和医院)，卢国萍[梅里埃诊断产品 (上海)有限公司]，季煦 (武汉大学健康学院)，刘勇 (中国医科大学附属盛京医院)，喻华 (四川省医学科学院四川省人民医院)，张樱 (解放军总医院第一医学中心)，柯江维 (江西省儿童医院)，李俊明 (南昌大学第一附属医院)，胡云建 (北京医院)，单斌 (昆明医科大学第一附属医院)，吴洁 (北京协和医院)，刘文恩 (中南大学湘雅医院)，杨滨 (福建医科大学附属第一医院)，阿祥仁 (青海省人民医院)，郭鹰 (陆军军医大学第一附属医院)，褚云卓 (中国医科大学附属第一医院)，朱镭 (山西省儿童医院山西省妇幼保健院)，张利侠 (陕西省人民医院)，康梅 (四川大学华西医院)，李彬 (福建医科大学附属协和医院)，刘小平 (北京大学深圳医院)，顾兵 (徐州医科大学附属医院)，佘丹阳 (解放军总医院)，徐雪松 (吉林大学中日联谊医院)，胡龙华 (南昌大学第二附属医院)，胡辛兰 (福建省立医院)，贾伟 (宁夏医科大学总医院)，李六亿 (北京大学第一医院)，魏莲花 (甘肃省人民医院)，张义 (山东大学齐鲁医院)，周俊 (圣湘生物科技股份有限公司)
执笔人 (按贡献度排序)：
王瑶 (北京协和医院)，李军 (解放军总医院第一医学中心)，宁雅婷 (北京协和医院)，罗燕萍 (解放军总医院第一医学中心)，周泽奇 ([丹娜 (天津)生物科技有限公司]，林勇平 (广州医科大学附属第一医院)，徐英春 (北京协和医院)
利益冲突：丹娜(天津)生物科技有限公司、北京贝尔生物工程股份有限公司和圣湘生物科技股份有限公司在本共识撰写过程中提供了技术支持 -
表 1 新型冠状病毒核酸检测常见注意事项及生物安全要求
步骤 注意事项 生物安全要求 样本采集 样本类型[2, 12]：
(1)普通筛查：推荐采集鼻咽拭子*[13-14]
(2)发热患者：
①发热门诊筛查：推荐采集鼻咽拭子
②处于疾病早期：推荐采集鼻咽拭子
③处于疾病中后期：除鼻咽拭子外，可采集下呼吸道样本(肺泡灌洗液、深部痰)、粪便、脑脊液[15]等，重症患者优先采集下呼吸道样本[12]
(3)阳性转阴患者：推荐采集鼻咽拭子
(4)疫情时期大规模筛查：推荐采集鼻咽拭子，可根据地方政策混合采样#[16]，不推荐混合检测
(5)环境检测：可根据地方政策混合采样(1)医务人员按照国家相关规定进行全流程防护[12, 17-18]，样本采集时注意避免医务人员与患者之间的交叉感染
(2)样本采集后立即插入含有病毒保存液的样本管，样本管单个装入密封袋
(3)制定样本洒漏应对措施[12]：对样本洒漏环境进行封闭，并使用含氯消毒剂或过氧乙酸消毒[12]；上报医院感控部门，严禁人员流动[19]，经会诊确定是否对暴露人群进行留观隔离
(4)工作结束后使用含氯消毒剂对环境消毒，并应用紫外线照射样本转运 (1)样本直立存放于转运箱内，应三层包装(即内层容器、第二层包装及外层包装)，且包装符合B类(UN3373)标准[12]，密封转运[20]
(2)样本采集后室温放置不宜超过4 h，应在2~4 h内送至实验室检测[21]；如未及时转运，4 ℃储存不宜超过24 h[22]，如需长途运输应使用干冰等低温保存[12]
(3)院间转运需有转运资质，专人专车[20](1)转运容器使用含氯消毒剂或酒精消毒[12]
(2)运输过程注意平稳，避免样本箱坠落导致致病性样本暴露于空气中，如有样本洒漏参照上述方法处理样本接收 (1)在生物安全柜内接收样本并核对样本信息
(2)不合格样本(渗漏、无标识等)登记后及时反馈临床或样本采集地点，并重新采样；不合格样本按生物污染垃圾处理(1)生物安全柜使用酒精消毒，并采用紫外线照射
(2)使用含氯消毒剂对样本管外表面消毒
(3)样本渗漏使用含氯消毒剂消毒，停止检测，密封打包，压力蒸汽灭菌后销毁[12]核酸提取 (1)建议对样本进行物理灭活(如56 ℃ 30 min等[23])或化学灭活(如采用含有胍盐的病毒保存管等[24])
(2)在生物安全二级及以上实验室进行[4]，有条件的单位可采用负压实验室
(3)手工提取规范操作，严格防止污染
(4)自动化提取按要求进行设备维护及消毒(1)实验室空气采用紫外线照射消毒，必要时使用核酸清除试剂
(2)工作台面、地面使用含氯消毒剂或酒精消毒
(3)生物安全柜使用酒精消毒
(4)如使用自动化提取仪，对仪器进行消毒
(5)样本局限性污染使用含氯消毒剂消毒；如样本倾覆，保持实验室空间密封，使用含氯消毒剂消毒，必要时采用过氧乙酸或高锰酸钾-甲醛熏蒸，污染物采用压力蒸汽灭菌处理[12]PCR扩增及报告解读 (1)阴性对照、阳性对照信号合格，方可发布报告
(2)根据样本信号值与试剂产品说明书阈值，进行结果判读(1)扩增过程PCR管密封
(2)对PCR室消毒医疗垃圾处理 (1)废液：化学或物理消毒后，排入实验室水处理系统
(2)固体废物：分类收集，压力蒸汽灭菌处理[12](1)在医疗垃圾产生地使用两层医疗垃圾袋扎口并粘贴“新型冠状病毒相关医疗废物”(或类似字样)后，进行压力蒸汽灭菌
(2)通过医疗废物通道转运垃圾*新型冠状病毒附着在人黏膜上皮细胞，因此刮取鼻黏膜上皮细胞进行检测阳性率高，筛查门诊或疑似患者优先推荐采集鼻咽拭子。鼻咽拭子对新型冠状病毒检测灵敏度优于口咽拭子，其样本采集要求亦高于口咽拭子[13]，样本采集医护人员需经过专业培训[18]；#将拭子混合于样本保存液中，如核酸检测阳性，通知相关部门对混合样本来源患者单个隔离，并逐一采集单管拭子复核[12] 
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表 2 新型冠状病毒抗体检测常见注意事项及生物安全要求
主要步骤 注意事项 生物安全要求 样本采集 (1)样本类型：血清、血浆或全血均适用，空腹血最佳，成人建议采集3~5 mL[32-33]，儿童按检测试剂盒要求的标本量进行采集
(2)针对人群：
①疑似患者：核酸检测阴性但有相关流行病学史、且肺部CT检查显示肺内病变符合新型冠状病毒肺炎影像特征的高度疑似患者，建议进行抗体检测辅助诊断
②发热患者：疫情中高风险地区发热患者或暴发流行期间发热患者，按照“1+3检查”模式(新型冠状病毒核酸检测、抗体检测、CT及血常规检测)进行检测；普通发热患者根据国家或地方规定进行检测
③境外入境人员：建议进行核酸抗体联合检测
④普诊筛查：一般不建议进行抗体检测(1)样本采集人员和检测人员应按照国家相关要求进行防护[33]
(2)采集血液样本应使用带有安全装置的针头；其他装备，如止血带，使用一次性装备[34]
(3)采血操作时预防针刺伤，加强职业防护，避免回套针帽、分离锐器等操作[19]
(4)采血拔针环节应注意防止血液迸溅和泄漏，造成环境污染
(5)采血后，使用酒精喷洒消毒采血管，标本单个装入密封袋
(6)工作结束后，使用含氯消毒剂对环境消毒，并应用紫外线照射样本转运 (1)抗体检测样本一般在院内转运，转运容器及要求同核酸检测样本
(2)30 min内送达实验室，一般不宜超过2 h；抵达实验室后，血清样本尽快离心，避免溶血[35](1)转运容器使用含氯消毒剂或酒精消毒
(2)运输过程注意平稳，避免样本箱坠落导致致病性样本在空气中暴露样本保存 (1)3 d内检测可于2~8 ℃存放，保存3 d以上的血清或血浆样本应存放于-20 ℃及以下，长期保存建议存放于-70 ℃及以下，全血样本不得冻存[34]
(2)应与其他样本分开保存，避免反复冻融使用含氯消毒剂或酒精消毒保存容器 样本接收 (1)生物安全柜内接收核对样本信息
(2)不合格样本(渗漏、无标识等)登记后及时反馈临床或样本采集地点，并重新采样；不合格样本按生物污染垃圾处理使用酒精消毒生物安全柜，并采用紫外线照射 样本处理与检测 (1)一般不对样本进行灭活处理
(2)在生物安全二级及以上实验室进行[33]，开盖操作或手工检测应在生物安全柜中进行(1)避免气溶胶传播，定期对实验室空气采用紫外线照射消毒[36]
(2)使用含氯消毒剂或酒精消毒工作台面
(3)使用酒精消毒生物安全柜报告解读 阴性对照、阳性对照及质控结果是否合格 医疗垃圾处理 (1)废液：化学或物理消毒后排入实验室水处理系统
(2)固体废物：分类收集，压力蒸汽灭菌处理[12](1)在医疗垃圾产生地，使用两层医疗垃圾袋扎口并粘贴“新型冠状病毒肺炎相关医疗废物”(或类似字样)后，进行压力蒸汽灭菌
(2)通过医疗废物通道转运垃圾
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表 3 新型冠状病毒核酸及抗体联合检测结果解读[31]
核酸 抗体 结果解读 IgM IgG - + + 感染恢复期，IgM尚未降低至检测下限或感染活跃期或接种疫苗早期，建议复查核酸和抗体 +/± - 感染急性期或接种疫苗早期，建议复查核酸和抗体 - + 既往感染或已接种疫苗，建议1~2周后复查核酸和抗体 - - 未感染或感染潜伏期，建议采用不同试剂和/或窗口期样本复查，必要时进行动态监测 + + + 感染活跃期 + - 感染早期，IgM已产生，但IgG暂未产生或水平未达到诊断试剂的检测下限 - + 感染期，IgM降低，IgG升高 - - 潜伏期或感染早期等，人体免疫系统尚未产生抗体或水平未达到检测下限，建议3~5 d后复查抗体，并密切医学观察
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