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Near-peer Learning in Neurology Residency Training on Electromyography
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摘要: 目的 探索“大带小”（near peer learning， NPL）教学模式在神经科住院医师一阶段规范化培养（下文简称“规培”）“肌电图”学习模块中的实施效果。 方法 北京协和医院神经科于 2020 年 11 月至 2024 年 3 月期间在北京市一阶段规培生神经系统辅助检查教学中探索实施 NPL 教学模式。具体教学方法：每年一次，以第三年规培生作为“主讲”，第一、二年规培生作为“学员”进行肌电图学习，客观评价方式为随机抽取试卷进行入口和出口理论测试，对比规培生培训前后成绩变化；主观评价方式为规培生通过问卷对课后学习感受进行多维度评分，以了解该模式对其专业知识、自信程度等方面的作用。 结果 研究期间共开展 4 次 NPL 教学，累计 83 人次规培生参加了该教学项目。其中，临床医学博士后 24 人次，专业型研究生 52 人次，基地规培生 7 人次。 结果显示，规培生出口平均成绩显著高于入口成绩（[ 74.33±2.43）分比（70.11±2.49）分， P=0.005]。亚组分析显示，作为“学员”的规培生[（73.84±20.53）分比（70.29±21.46）分，<P=0.02]、专业型研究生[（74.04±22.51）分比（68.97±21.40）分， <P=0.009]、第一年规培生[（70.19±4.02）分比（63.59±3.59）分， <P=0.04]、第一次参加该课程的规培生[（65.23±3.24）分比（60.97±3.21）分， P=0.03]其出口成绩较入口成绩提高显著。问卷调查结果显示， 96.69%的“学员”规培生对课程内容、形式及效果表示满意或很满意， 100%的规培生感觉“能力有实质性提高”。 结论 NPL模式有助于神经科住院医师一阶段规培学员夯实神经系统辅助检查相关基础知识，提高解决临床实际问题的能力，值得在其他教学项目和教学基地中推广应用。Abstract: Objective This study aims to explore the effectiveness of "Near Peer Learning" (NPL) in the（ electromyography， EMG） teaching module for neurology residents. Methods The Department of Neurology， Peking Union Medical College Hospital implemented an NPL instructional design for a course on EMG for residents from November 2020 to March 2024. This teaching session is held annually, in which senior residents instruct juniors who are only 1 or 2 years earlier in their training. The residents participate in the precourse/postcourse tests and complete a feedback survey at the end of the session. This evaluation method is used to understand the effectiveness of the NPL intervention in EMG teaching. Results Over four years, a total of 83 residents participated. The results showed that the postcourse test scores were significantly improved compared with precourse test scores (74.33 ± 2.43 vs. 70.11 ± 2.49, P= 0.005), with the most remarkable improvements seen for “tutees” (P= 0.02), graduate students (P= 0.009) and first-year residents (P= 0.04). Both tutors and tutees thought highly of NPL, believing it enabled them to gain knowledge and helped them to improve teaching skills. Conclusion The NPL intervention is suitable for teaching of EMG, for its contribution to knowledge acquisition and core competencies enhancement in residents.
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原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是一种由基因、免疫、环境等多因素共同作用而引起的器官特异性自身免疫性疾病, 感染是其重要的促发因素之一, 主要作用机制是分子模拟[1]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革兰阴性细菌表面的主要结构成分, 由Toll样受体-4 (Toll-like receptor 4, TLR4)识别, 两者均被认为与肝内胆管疾病的发病有关[2]。PBC患者肝脏中有多种细胞因子存在, 即使在未出现临床症状的疾病早期, 肝脏已有部分细胞因子高水平表达。本研究通过观察PBC患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)在体外分泌细胞因子的特点及其对LPS刺激的反应, 探讨LPS和细胞因子在PBC发病机制中的作用。
对象和方法
对象
21例PBC患者和8例原发性干燥综合征(primary sjögren's syndrome, pSS)患者均来自北京协和医院风湿免疫科, 其中pSS患者为疾病对照组; 健康对照组为11例北京协和医院健康志愿者。PBC患者符合美国肝脏病学会2000年制定的PBC分类标准[3], pSS患者符合2002年欧洲分类(诊断)标准[4]。该研究由北京协和医院伦理委员会审批通过, 所有参与研究的患者均签署了知情同意书。
方法
PBMCs分离和培养:密度梯度离心法分离外周血, 获得PBMCs, 计算细胞密度及细胞活率。加入RPMI 1640完全培养基(GIBCO BRL)或含LPS (Sigma公司)的RPMI 1640完全培养基, 使每孔液体终体积为1ml, 置于细胞培养箱, 37℃、5%CO2条件下培养。实验一不加LPS培养, 24 h后收集上清液; 实验二加LPS培养, LPS终浓度为0.01 mg /ml, 24 h后收集上清液; 实验三LPS终浓度分别为0.1和1.0 mg /ml, 并分别于24和48 h收集上清液。上清液保存于-20℃冰箱。
细胞因子检测:采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测所收集上清液中的细胞因子——白细胞介素1β (inerleukin-1β, IL-1β)、白细胞介素2 (IL-2)、白细胞介素6 (IL-6)、白细胞介素10 (IL-10)、肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)和干扰素γ(interferon-γ, IFN-γ)浓度(北京晶美生物公司), 操作程序按ELISA试剂盒说明。
统计学处理
应用SPSS 14. 0 for Windows软件进行统计学分析。正态分布的计量资料用x±s表示, 组间比较采用independent-samples t检验, 组内比较采用pairedsamples t检验, P < 0. 05表示差异有统计学意义。
结 果
一般情况
21例PBC患者中女性20例, 男性1例; 9例为冻存复苏的PBMCs, 平均年龄(49. 5 ±5. 3)岁; 12例为新鲜采集分离的PBMCs, 平均年龄(61. 9±6. 9)岁。8例pSS患者均为女性, 平均年龄(46. 9 ± 15. 3)岁。11例健康对照者中女性10例, 男性1例, 平均年龄(49. 6 ±8. 9)岁。四组对象的年龄与性别差异无统计学意义(P > 0. 05)。
新鲜采集分离PBMCs与液氮冻存复苏PBMCs上清液的细胞因子比较
在无LPS刺激新鲜采集分离PBMCs与液氮冻存复苏的PBMCs上清液中, IL-1β、IL-2、IL-10和TNF-α水平比较差异无统计学意义(P>0. 1), 前者仅IL-6水平高于后者, 差异有统计学意义(P= 0. 035)。LPS(以下若无特殊说明, LPS终浓度均为0. 01mg /ml)刺激后, 前者IL-1β、IL-6及IL-10水平均高于后者, 差异有统计学意义(分别为P= 0. 029、P=0. 014及P=0. 009) (表 1)。以下研究均采用新鲜PBC组(简称PBC组)与健康对照及pSS疾病对照组PBMCs的细胞因子比较。
表 1 新鲜采集分离P BMCs与液氮冻存复苏PBMCs上清液的细胞因子比较培养条件 IL-1β (pg /ml IL-2 (U/ml) IL-6(pg /ml) IL-10(pg /ml) TNF-α(pg /ml) 无LPS刺激 新鲜PBC 1645±1677 2. 36±0. 18 45 763 ±43484 721±701 2962±2944 冻存PBC 1761±1871 1. 97±0. 61 14 982 ±10931 533±349 3063±1499 P值 0. 879 0.452 0.035 0.368 0.723 LPS刺激 新鲜PBC 5196±2641 1. 86±0. 35 73 169 ±46387 1003 ±629 5827±2154 冻存PBCs 2581±2320 2. 30±1. 12 28 229 ±19874 347 ±278 5353±3029 P值 0. 029 0.396 0.014 0.547 0.009 PBMCs :外周血单个核细胞; LPS:脂多糖; I L:白细胞介素; TNF-α:肿瘤坏死因子α 无LPS刺激三组PBMCs的细胞因子表达
不加LPS刺激, PBC组PBMCs上清液的IL-2水平高于健康对照组, 差异有统计学意义(P﹤ 0. 05);PBC组与pSS组PBMCs上清液IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α水平比较, 差异均无统计学意义(表 2)。
表 2 无LPS刺激PBMCs的细胞因子表达培养条件 IL-1β (pg /ml IL-2 (U/ml) IL-6(pg /ml) IL-10(pg /ml) TNF-α(pg /ml) 健康对照 842± 602 2. 07±0. 30 29 468 ±32446 646±674 1605±1454 pSS 2646±3390 2. 49±1. 39 33 920 ±17500 334±325 3584±4017 PBC 1645±1677 2. 36±0. 18* 45 763 ±43484 721±701 2962±2944 pSS:原发性干燥综合征; PBC:原发性胆汁性肝硬化; 与健康对照组比较, *P﹤0. 05 LPS刺激后三组PBMCs的细胞因子表达
0. 01mg /ml LPS刺激24 h后, PBMCs上清液细胞因子水平与无LPS刺激的特点基本一致, 仅差异更加显著(表 3)。PBC组与健康对照组比较, IL-1β、IL-2和TNF-α水平明显升高, 差异具有统计学意义(分别为P﹤ 0. 01、P﹤0. 05和P﹤0. 01);IL-6和IL-10两组间比较差异无统计学意义(分别为P=0. 476和P=0. 593)。PBC组与pSS组比较, IL-6水平升高, 差异具有统计学意义(P=0. 001);其他细胞因子两组间比较差异无统计学意义
表 3 LPS刺激后PBMCs的细胞因子表达培养条件 IL-1β (pg /ml IL-2 (U/ml) IL-6(pg /ml) IL-10(pg /ml) TNF-α(pg /ml) 健康对照 1525±1022 1. 54±0. 28 57 933 ±54206 1183 ±939 3582±1292 pSS 4054±2742 2. 46±0. 82 13 391 ± 5425 529 ±596 5207±3742 PBC 5196±2641** 1. 86±0. 35* 73169±46 387† 1003±629 5827±2154** 与健康对照组比较, *P < 0. 05, **P < 0. 01;与pSS组比较, †P < 0. 001 有无LPS刺激对PBMCs细胞因子表达的影响
组内比较:PBC组, LPS刺激后IL-1β、IL-6和TNF-α水平较无刺激时增高(分别为P﹤0. 001、P﹤ 0. 005和P﹤0. 001), 而IL-2则降低(P﹤0. 001), 差异均具有统计学意义。健康对照组, LPS刺激后IL-1β、IL-10和TNF-α较无刺激时增高(分别为P﹤ 0. 01、P﹤0. 05和P﹤0. 001), IL-2降低(P= 0. 001), 差异亦均具有统计学意义(表 4)。
表 4 有无LP S刺激对PBC与健康对照组PBMCs细胞因子的影响培养条件 IL-1β (pg /ml IL-2 (U/ml) IL-6(pg /ml) IL-10(pg /ml) TNF-α(pg /ml) 健康对照 1525±1022 1. 54±0. 28 57 933 ±54206 1183 ±939 3582±1292 pSS 4054±2742 2. 46±0. 82 13 391 ± 5425 529 ±596 5207±3742 PBC 5196±2641** 1. 86±0. 35* 73169±46 387† 1003±629 5827±2154** 与健康对照组比较, *P < 0. 05, **P < 0. 01;与pSS组比较, †P < 0. 001 组间比较:LPS刺激后PBC组IL-1β升高幅度高于健康对照组, IL-2降低幅度低于健康对照组, 差异均有统计学意义(P﹤0. 05);而IL-6、IL-10和TNF-α升高幅度两组间差异无统计学意义(P > 0. 05)(表 5)。
表 5 LPS刺激后 PBMCs上清液细胞因子的变化(%) 组 别 IL-1β IL-2 IL-6 IL-10 TNF-α 健康对照 90 ± 72 -26 ±13 221 ±297 132 ±100 220 ±139 pSS 276 ±320 16 ±47 -23 ±121 161 ±241 160 ±162 PBC 462 ±580* -21 ±14* 228 ±438 92 ±135 247 ±232 与健康对照组比较 , *P<0.05 有无LPS刺激对PBMCs细胞因子表达的影响
无LPS刺激和0. 01 mg /mlLPS培养24 h后, PBC组和健康对照组PBMCs上清液中均几乎检测不到IFN-γ; 0. 1和1. 0mg /mlLPS分别培养24和48 h后, 两组PBMCs上清液中仍检测不到IFN-γ(表 6)
表 6 不同条件培养的 PBMCs上清液中的 IFN-γ水平(U/ml) 培养条件 健康对照 (n=11) PBC (n=12) 24 h 48 h 24 h 48 h 无 LPS刺 激 -0.71 ±0.42 -0.56 ±0.35 -0.58 ±0.42 -0.57 ±0.45 LPS刺激 (mg/ml) 0.01 -0.76 ±0.49 -0.73 ±0.48 -0.56 ±0.41 -0.51 ±0.41 0.1 -0.81 ±0.50 -0.61 ±0.35 -0.64 ±0.54 -0.59 ±0.45 1.0 -0.86 ±0.59 -0.82 ±0.56 -0.66 ±0.53 -0.66 ±0.54 讨 论
PBMCs是一个包含了单核细胞、淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)等多种免疫细胞的复杂体, 其活性在一定程度上反映了机体外周血的免疫状态。PBMCs在体内被激活后产生细胞因子, 后者若不被激活则凋亡[5]。本研究分离得到的PBMCs在体外不加任何刺激条件下培养24 h, 其上清液细胞因子— IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α水平均有所上升。PBC患者PBMCs分泌的以上细胞因子水平普遍高于健康对照者, 但只有IL-2在两组间的差异具有统计学意义。提示本研究分离得到的PBMCs在体内已被激活, 而PBC患者体内的慢性炎症使其PBMCs活化程度高于健康对照者; IL-2与TNF-α同属Th1细胞分泌的细胞因子, 因此该结果也支持PBC患者以Th1型细胞因子占优势的结论[6-7]。然而, 本实验也同时检测到了IL-6、IL-10等Th2型细胞因子, 与某些研究结果[8-9]一致, 说明PBC患者Th2型细胞因子虽非优势亚型, 但其对疾病的发生发展也有一定作用。
液氮冻存后复苏的PBMCs, 在自然状态下培养仅发现IL-6水平与新鲜PBMCs比较差异有统计学意义, 从整体细胞因子水平看, 两者差异并不显著; 但两者对LPS刺激的反应却明显不同。冻存复苏后的PBMCs虽然基本维持了之前体内的活化水平, 但冻存过程的确对PBMCs的生物学活性产生了一定的影响。因此, 本实验分析结果时, 仅采用新鲜PBC组(简称PBC组)与健康对照和疾病对照组进行比较, 而未采用包含冻存细胞的PBC全部组, 虽然这样处理导致了样本量变小, 但毕竟剔除了该部分可能引起的偏倚。同时, 也为以后类似的实验和临床检测提供了理论依据, 即应当尽可能避免使用液氮冻存的PBMCs细胞。
LPS是革兰阴性菌表面的主要结构成分, 也是一种重要的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP), 是众所周知的免疫系统激活因素。研究表明, PBC患者革兰阴性菌反复感染的阳性率明显高于正常人群[10]。免疫组化结果也显示, LPS在PBC患者的Kupffer细胞、肝细胞和胆管上皮细胞中有异常积聚[11]。另外, 64%PBC患者血清中存在抗类脂A(LPS的免疫活性成分和毒性成分)抗体, 且水平与肝组织损伤的严重程度及血清免疫球蛋白M (IgM)水平呈正相关[2]。因此, 本研究选择LPS作为PBMCs的刺激物, 以了解其在PBC发病中的作用。用终浓度为0. 01 mg /ml的LPS与PBMCs共同在体外培养24 h后检测其上清液的细胞因子表达, PBC患者较健康对照者IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α水平明显升高。这一结果与体外LPS刺激单核细胞的实验结果基本一致[12]。但本实验结果表明, 无LPS刺激的PBMCs上清液中已经有了相当水平的细胞因子分泌, 提示用LPS刺激后得到的细胞因子水平的升高, 很可能与细胞本身活化状态较高、细胞因子分泌水平基线较高有关, 可能并不足以说明PBC患者PBMCs对LPS刺激有高反应性。用细胞因子变化幅度做为变量衡量PBMCs受LPS刺激后分泌活性的变化, 结果发现仅IL-1β升高幅度在PBC患者较健康对照者显著升高, 其他细胞因子的变化幅度两组间没有明显差异。说明LPS在PBC的发病中可能起一定作用, 推测革兰阴性菌感染可能是PBC发病的原因之一。
在众多细胞因子中, IL-1β的变化具有统计学意义。IL-1β由单核-巨噬细胞和内皮细胞产生, 其功能主要包括发热、激活T细胞和巨噬细胞, 因此也属于Th 1型细胞因子的范畴。有文献报道, 在LPS和鞭毛蛋白(另一种PAMP, 受体为TLR5)刺激下培养的PBMCs所分泌的IL-1β分别是正常对照组的3. 1和2. 4倍[8]。免疫组化结果证实, IL-1β的免疫作用主要发挥在肝窦细胞上, 其活性在PBC患者明显高于慢性丙型肝炎患者[13]。考虑到IL-1是T细胞增殖分化的重要共刺激成分, IL-1β升高可能在自身免疫增强的PBC发病中起到或多或少的作用, 而其下降也可能是慢性丙型肝炎患者免疫功能低下的原因之一。
在PBC中, IFN-γ是一个比较突出的细胞因子, 各种研究表明IFN-γ在PBC患者外周血血清、骨髓细胞体外培养的上清液和肝脏细胞中的表达水平都高于健康对照者[14]。IFN-γmRNA阳性细胞主要存在于被破坏胆管周围聚集的淋巴样物质中, 其表达的染色密度与肝脏汇管区的炎症反应程度呈正相关; PBC患者肝脏组织中提取的RNA分析也表现出IFN-γ mRNA表达的上调[6]。但本实验几乎检测不到PB-MCs上清液中有IFN-γ存在, 即使增加LPS浓度并延长培养时间, 也未能检测到IFN-γ, 与以上研究结论相悖。令人疑惑的是, 如果PBMCs不是IFN-γ的主要来源, 那么PBC患者血清中的IFN-γ为何升高, 它们来自哪里。以往研究表明, IFN-γ是由T细胞和NK细胞合成的, 而PBMCs含有这两种细胞[5]。是否可以推测, 本组PBC患者PBMCs中T细胞和NK细胞的比例较低, 以致无法在上清液中检测到IFN-γ。当然, 也有些研究[15]与本实验结果一致。
在临床工作中, 常发现PBC与pSS有同时出现的相关性[16-17], 因此有些学者认为两者可能同属一种疾病范畴。研究表明, pSS患者的抗S SA抗体、抗SSB抗体和抗RNP抗体的阳性率明显高于PBC患者; 而PBC患者的抗线粒体抗体(尤其是AMA-M2)、抗Sm抗体、抗Jo-1抗体及抗I型胶原抗体等抗体的阳性率则明显高于pSS患者[16]。为此, 本实验设计了单纯pSS患者与单纯PBC患者的对照, 结果发现LPS刺激后PBMCs上清液中的IL-6水平在两组间的差异有统计学意义, 这在某种意义上说明, PBC与pSS并不是同一种疾病, 而是两个独立的疾病。但由于临床研究的限制性, pSS入组患者仅有8例, 且仅测量了为数不多的几种重要的细胞因子的表达, 其他众多细胞因子的变化是否存在差异、仅凭IL-6分泌水平的变化是否能说明pSS患者与PBC患者PB-MCs功能存在不同的特点, 还需要设计更为严格、样本量更大的实验进行观察和研究。
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期刊类型引用(1)
1. 张国胜. 原发性胆汁性肝硬化临床特点分析. 中外医疗. 2012(14): 80 . 
百度学术
其他类型引用(2)
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